Search for new genes, molecular mechanisms and diagnostic tools in postlingual hereditary hearing loss

Resumen

Las hipoacusias neurosensoriales no sindrómicas son el trastorno sensorial más común y son genéticamente heterogéneas. La identificación de nuevos genes y variantes asociados a hipoacusia avanza rápidamente, por lo que el uso de herramientas de secuenciación masiva (NGS) es esencial para realizar un diagnóstico genético. En este trabajo, hemos utilizado OTO-NGS-panel V2, un panel de NGS diseñado por nuestro grupo que contiene 117 genes asociados a hipoacusias para estudiar el espectro mutacional de las hipoacusias no sindrómicas de herencia autosómica dominante (AD) en la población española. OTO-NGS-panel V2 fue validado para la identificación de mutaciones puntuales, pequeñas inserciones y deleciones y variaciones del número de copias. Con esta herramienta, se analizaron 108 familias con hipoacusia no sindrómica e identificamos la variante causal en 39 casos, lo que constituye una tasa diagnóstica del 36,11%. Los genes con mayor prevalencia son WFS1 (7,41 %), seguido de MYO7A (5,56 %), MYO6 (4,63 %), TECTA (2,78 %) y ACTG1 (2,78%). Para estudiar los casos no diagnosticados, diseñamos un panel de genes candidatos, que incluye genes asociados a sordera en ratón pero sin mutaciones reportadas en humanos hasta la fecha. Se identificaron variantes candidatas en los genes XIRP2, USP31, PLS1 y KCNK5. Por otro lado, hemos utilizado modelos celulares y animales para investigar los mecanismos de patogénesis de la hipoacusia asociada a mutaciones en CCDC50 y MIR96, respectivamente. Identificamos una nueva mutación en CCDC50 (c.828_858del, p.(Asp276Glufs*40)) que segrega con la hipoacusia en una familia española con un patrón de herencia AD. Para estudiar el mecanismo de patogénesis de estas mutaciones, realizamos estudios in vitro utilizando seis mutaciones artificiales y dos mutaciones humanas p.(Asp276Glufs*40) y p.(Phe292Hisfs*37). Determinamos que solo los mutantes que contienen la secuencia de 6 aminoácidos CLENGL en su cola proteica aberrante muestran una distribución anormal que consiste en agregados perinucleares de Ymer, la proteína codificada por CCDC50. Por lo tanto, concluimos que la secuencia CLENGL es necesaria para formar los agregados de Ymer. Estos resultados, junto con nos umbrales auditivos normales en ratones con pérdida de función de Ccdc50 (Ccdc50tm1a y Ccdc50tm1b), sugieren que las dos mutaciones humanas en CCDC50 ejercen su efecto a través de un mecanismo dominante negativo o de ganancia de función en lugar de haploinsuficiencia. Por último, investigamos los mecanismos patológicos de hipoacusia asociada a mutaciones en miR-96, un microRNA que actúa como regulador de la transcripción en el oído interno y coordina la maduración de las células ciliadas. Se ha descrito que mutaciones puntuales en la región semilla de miR-96 causan pérdida auditiva progresiva de herencia AD en humanos y ratones. En este trabajo, presentamos dos modelos de ratón que portan dos mutaciones puntuales causantes de hipoacusia progresiva en humanos (Mir96s403 y Mir96s1334). Los ratones homocigotos para ambas mutaciones presentan sordera profunda, los ratones Mir96s1334 heterocigotos tienen una pérdida auditiva progresiva leve, pero los Mir96s403 heterocigotos tienen una audición normal. Los ratones Mir96s403 homocigotos tienen una reducción en el número de sinapsis de las células ciliadas internas a las cuatro semanas de edad. Además, secuenciación del RNA (RNA-seq) del órgano de Corti de ratones de 4 días de edad mostró que los ratones Mir96s1334 homocigotos tienen un mayor número de genes diferencialmente expresados que los Mir96s403 homocigotos, lo que se correlaciona con el fenotipo estructural más severo observado en estos mutantes. En general, esta tesis proporciona información sobre los genes con más mutaciones en una cohorte de familias españolas con hipoacusia neurosensorial y sugiere posibles mecanismos para la pérdida de audición causada por mutaciones en CCDC50 y MIR96.