Implementación de plataformas biosensoras ópticas basadas en nuevos elementos de reconocimiento selectivo para la monitorización de inmunosupresores en muestras sanguíneas

Resumen

Los trasplantes de órganos han aumentado notablemente en los últimos años a escala mundial. El éxito de la intervención y la correcta recuperación del paciente dependen, entre otros factores, del empleo de medicamentos inmunosupresores (ISDs) administrados para evitar el rechazo del órgano trasplantado. Los ISDs presentan ventanas terapéuticas estrechas y gran variabilidad en la absorción inter e intraindividuo, que originan niveles muy variables en sangre. Para asegurar la máxima respuesta terapéutica y los mínimos efectos adversos, es necesario su control regular en los pacientes. La determinación de ISDs en los laboratorios clínicos se realiza, principalmente, mediante métodos basados en cromatografía líquida acoplada a diferentes detectores. Estas técnicas requieren de personal especializado y su coste y el tiempo de análisis pueden ser elevados. Además, estas metodologías no son adecuadas para la monitorización continua o semicontinua de fármacos. Los inmunoensayos (IAs), basados en el uso anticuerpos, se utilizan habitualmente en los laboratorios de análisis clínicos para la monitorización rápida y a bajo coste de fármacos, pudiendo formar parte de dispositivos de análisis in situ. Últimamente se ha aumentado la variedad de receptores específicos a ISDs disponibles para su análisis (e.j. anticuerpos recombinantes y bioreceptores), que minimizan la reactividad cruzada con sus correspondientes metabolitos y otros fármacos coadministrados con el ISD. El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha sido el desarrollo de nuevos biosensores para el análisis de ISDs en muestras de pacientes trasplantados. Por ello, se han explorado diferentes formatos de ensayo y estrategias de medida, evaluando su impacto en las características analíticas. Se han diseñado nuevos bioreceptores, o derivados fluorescentes de los analitos, para conseguir una detección más sensible, rápida y selectiva de los ISDs ácido micofenólico (MPA) y tacrolimus (FK506). En la primera parte se describe el desarrollo de un IA homogéneo, basado en medidas de polarización de fluorescencia. El empleo de un análogo fluorescente del MPA, proporcionó una sensibilidad excelente, ajustándose a los requerimientos terapéuticos, y mejorando los límites de detección (LODs) de los IAs descritos hasta la fecha de la publicación. El ensayo desarrollado se aplicó satisfactoriamente al análisis de MPA en suero de un paciente trasplantado. En la segunda parte se han desarrollado bioensayos basados en medidas de luminiscencia para el análisis de FK506, donde se han diseñado y producido receptores recombinantes fluorescentes como alternativa a los anticuerpos usados en los IAs. Las proteínas de fusión sintetizadas están formadas por el receptor FKBP1A y una proteína fluorescente (la proteína verde fluorescente Emerald, EmGFP, o la proteína naranja fluorescente mOrange2). Esta estrategia permite la producción ilimitada a bajo coste del receptor, evitando variaciones entre lotes. La interacción entre los receptores recombinantes fluorescentes y el FK506 se evaluó mediante microbalanza de cristal de cuarzo. Las proteínas recombinantes se han aplicado al desarrollo de dos ensayos heterogéneos competitivos. El primero emplea partículas magnéticas (MB) modificadas con FK506 y la proteína FKBP1A-EmGFP y se aplicó satisfactoriamente al análisis de FK506 en muestras de sangre de pacientes trasplantados. El segundo bioensayo emplea micromotores magnéticos tipo Janus modificados con FK506. Estas micropartículas se desplazan autónomamente en disolución, induciendo una mezcla eficaz de los fluidos que permite acelerar las interacciones y mejora las características analíticas del método. En comparación con el ensayo basado en MB se realiza en una única etapa, reduciendo el tiempo de análisis, muestra un LOD menor y un mayor intervalo dinámico, aunque la reproducibilidad es ligeramente inferior. Este método presenta un gran potencial para la determinación de FK506 en muestras biológicas.