Synthesis, biophysical and biological evaluation of N -phenylbenzamidederivatives targeting the mitochondrial DNA of kinetoplastid parasites

Resumen

Los tripanosomátidos Trypanosoma brucei, T. cruzi y Leishmania son parásitos kinetoplástidos (Clase Kinetoplastea) responsables de tres zoonosis transmitidas por insectos vectores (la tripanosomiasis africana humana, la enfermedad de Chagas, y la leishmaniasis, respectivamente) que causan altas tasas de morbilidad y mortalidad, principalmente en países en vías de desarrollo. Los parásitos kinetoplástidos se caracterizan por la presencia de un ADN mitocondrial en forma de disco, denominado ADN del kinetoplasto (ADNk), que comprende > 70 % de pares de bases AT. Trichomonas vaginalis, un parásito anaerobio amitocondriado, muy diferente morfológica y biológicamente de los kinetoplástidos, comparte con éstos un ADN con alto contenido en AT, por lo que se ha utilizado también como modelo en los ensayos biológicos. El objetivo principal de esta Tesis fue sintetizar y estudiar nuevos compuestos antiparasitarios cuya diana es el ADNk de los parásitos Leishmania, T. cruzi y T. brucei. Estos compuestos fueron diseñados basándose en la estructura del derivado bis(2-aminoimidazolínico) I, un ligando del surco menor (LSM) del ADN que es 100% curativo en ratones infectados por T. b. rhodesiense, aunque resulta mayormente inactivo contra los parásitos intracelulares T. cruzi y Leishmania. Se sintetizaron tres familias de compuestos dicatiónicos que tuvieran el esqueleto común de N-fenilbenzamida del compuesto I, probándose diferentes modificaciones químicas para mejorar la permeabilidad de la membrana y, por lo tanto, la capacidad anti-T. cruzi y la actividad leishmanicida de las nuevas moléculas. Para obtener la serie bis(arilimidamida) halogenadas (3a e, 3g i, 36, 37, 53), se desarrolló un nuevo protocolo utilizando N-(terc-butoxicarbonil)piridin-2-carbimidotioato (44). La actividad antiprotozoaria y la citotoxicidad inespecífica de estos compuestos se evaluó in vitro, así como su afinidad y modo de unión al ADN mediante estudios biofísicos y computacionales (docking molecular). Además, se obtuvieron cristales de los compuestos 1c, 3a y 36 complejados con ADN rico en AT y se difractaron en el Sincrotrón ALBA. Finalmente, se sintetizaron nanopartículas lipídicas transportadoras (NLC) cargadas con el compuesto más activo, 3a, como estrategia de administración del fármaco para mejorar su actividad leishmanicida. Los experimentos biofísicos (ej. desnaturalización térmica, resonancia de plasmones de superficie (SPR), dicroísmo circular (CD), dicroísmo lineal (LD), UV-Vis, 1H-RMN) mostraron que los derivados de bis(imidazolidin-2-imina) (1b h) y de bis(arilimidamida) (3a e, 3g i, 36, 37, 53) se unen selectivamente (excepto 53) a secuencias de ADN ricas en AT y que son LSM. Por otra parte, se determinó que los derivados de bis(2-aminobenzimidazol) (2a e, 2h, 30, 31, 34) se unen al ADN, aunque su modo de unión queda por determinar. Los compuestos de la serie 1 mostraron actividad a concentraciones micromolares contra T. brucei (5,71 a 78,5 µM) con índice de selectividad (IS) de 1,3 a > 35, siendo el derivado clorado 1c el más activo y selectivo de esta serie. Toda la serie fue inactiva frente a T. cruzi y T. vaginalis. La serie 2 mostró actividad en el rango micromolar sobre T. brucei mientras que fue prácticamente inactiva contra T. cruzi y Leishmania. Los derivados de bis(arilimidamida) (serie 3) son inhibidores muy potentes y selectivos del crecimiento T. brucei y de las formas intracelulares de T. cruzi y Leishmania. El compuesto 3a, con actividad a nivel submicromolar y alta selectividad contra estos 3 parásitos kinetoplástidos, es estable frente al metabolismo hepático (humano y de ratón) y en suero humano, por lo que es un excelente candidato para futuros ensayos in vivo. Se prepararon con éxito NLC cargadas con el compuesto 3a y se evaluó su estabilidad. Las NLC sin funcionalizar resultaron muy estables a temperatura ambiente (60 días), mientras que las NLC funcionalizadas con ácido fólico mostraron una estabilidad limitada ( < 21 días)