Bioquímica de sistemas de interacciones macromoleculares implicadas en la regulación de la estabilidad del anillo de división en bacterias

Resumen

En E coli el primer paso en el proceso de división es el ensamblaje del anillo Z, que implica la polimerización de la proteína FtsZ y que actúa como plataforma sobre la que se incorporan otras proteínas de división. El correcto posicionamiento de este anillo en el centro de la célula, asegurado en E. coli por varios mecanismos, es crítico para la generación de células hijas viables. Entre estos mecanismos, la oclusión por nucleoide mediada por SlmA inhibe la formación del anillo Z en la vecindad del cromosoma, mientras que el anclaje Ter, en el que participa la proteína de unión a ADN MatP, refuerza su formación en posiciones centrales. El ensamblaje regulado del anillo Z tiene lugar en el entorno intracelular, caracterizado por la aglomeración macromolecular que, entre otros efectos, favorece la formación de condensados biomoleculares por separación de fases, considerados elementos cruciales en la organización del espacio intracelular. De la misma forma, la membrana lipídica que delimita el interior celular juega un papel esencial en la citocinesis. En esta tesis se describe el ensamblaje de condensados formados por FtsZ en presencia o ausencia de la proteína SlmA, bajo condiciones de aglomeración. La reconstitución de FtsZ (en ausencia de GTP) y SlmA, unida a su secuencia específica de ADN (SBS), evidenció la formación de estructuras micrométricas compatibles con condensados líquidos, analizados mediante microscopía confocal y ensayos de turbidez. Se demostró que estos ensamblados son dinámicos y reversibles, cualidades distintivas de los condensados biomoleculares, y que FtsZ conserva sus propiedades de polimerización dependiente de GTP. Los condensados encapsulados en contenedores citomiméticos se localizan principalmente cerca de la superficie lipídica. Una exploración más exhaustiva abarcando un mayor número de condiciones, dentro del rango fisiológico descrito para E. coli, reveló que FtsZ puede formar reversiblemente condensados biomoleculares dinámicos por sí misma, en condiciones que promueven su oligomerización. Se observó que la encapsulación de FtsZ en contenedores citomiméticos favorece la formación de condensados, sugiriendo un posible efecto del confinamiento y/o de la membrana lipídica en su generación. Ensayos con un mutante de FtsZ que carece del dominio no estructurado C-terminal demostraron que esta región no es estrictamente necesaria para la formación de condensados, aunque probablemente participa potenciando el proceso global. En esta tesis también se ha identificado, analizado y discutido la interacción de las proteínas de unión a ADN SlmA y MatP con lípidos, usando diferentes sistemas mínimos de membrana y métodos ortogonales bioquímicos, biofísicos y de imagen. Se observó que SlmA es capaz de unirse tanto a la mezcla ternaria de lípidos de E. coli, que contiene componentes con carga negativa, como a fosfatidilcolina, un fosfolípido neutro. La afinidad aumenta a baja fuerza iónica, pero apenas varía por encima de un cierto límite, sugiriendo la implicación de fuerzas tanto electrostáticas como hidrofóbicas. Análisis en presencia de las secuencias SBS mostraron que éstas compiten con los lípidos por la unión a SlmA. La inclusión de FtsZ promueve el reclutamiento de secuencias SBS a la membrana mediado por SlmA. La reconstitución de MatP en membranas biomiméticas también derivó en el hallazgo de que esta proteína es capaz de unirse a lípidos. La interacción de MatP con la mezcla de lípidos de E. coli se detectó a concentraciones submicromolares de proteína, siendo la interacción relativamente insensible a la fuerza iónica. También se observó unión de MatP a fosfatidilcolina, indicando que probablemente la interacción entre MatP y lípidos se encuentra mediada por fuerzas hidrofóbicas. Finalmente, la inclusión de las secuencias de ADN reconocidas por MatP (matS) en los experimentos de unión a membranas lipídicas demostró que no se forman complejos ternarios, sino que matS compite por la unión a MatP.