Slingshot-1expresión, distribución y papel regulador en el sistema inmunitario

Zusammenfassung

La respuesta immunitaria adaptativa depende de la correcta regulación del citoesqueleto de actina. En los linfocitos T, el citoesqueleto es importante durante el reconocimiento antigénico, en la formación de la sinapsis inmunitaria (IS) y en la migración celular. El citoesqueleto de actina también es importante en las células dendríticas (DCs), tanto en su estado inmaduro para facilitar su movimiento en los tejidos, gracias a los podosomas, como en células maduras, facilitando la migración hacia los nódulos linfáticos y favoreciendo la presentación de antígenos. Cofilina es un regulador del citoesqueleto que desestabiliza los filamentos de actina y favorece la depolimerización del citoesqueleto. Es una proteína de especial interés en la regulación de procesos inmunitarios, como la IS o la migración celular. La actividad de cofilina está regulada por una serie de proteínas, como la fosfatasa Slingshot 1 (SSH1), responsable de la activación de cofilina. El papel de SSH1 en el sistema inmunitario apenas ha sido estudiado. El objetivo principal de esta tesis es estudiar el papel de SSH1 en dos tipos celulares de interés: linfocitos T CD4 y DCs. Para esto, se analizaron diferencias en su expresión tras diferenciación o maduración, su efecto sobre la activación de cofilina, y su distribución y papel regulador durante la activación linfocitaria y en podosomas de DCs. En el estudio de los linfocitos T CD4 se emplearon células primarias extraídas de sangre periférica y la línea celular Jurkat (JK). La expresión de SSH1 durante la diferenciación del linfocito aumentó, coincidiendo con la activación de cofilina. A continuación, se eliminó la expresión de SSH1 mediante la edición genómica basada en CRISPR/Cas9, y se observó que pequeñas cantidades de SSH1 son suficientes para mantener activa cofilina en células primarias diferenciadas. Al emplear esta herramienta en JK en reposo, se observó que eliminar la expresión de SSH1 no altera el estado de activación de cofilina. Sin embargo, durante el reconocimiento antigénico, células SSH1 KO mostraron una menor activación de cofilina y una disminución en marcadores de activación linfocitaria (fosforilación de ERK1/2, expresión de CD69 y secreción de IL 2). Con respecto a su distribución en la IS, SSH1 se acumula en las regiones periféricas de la interacción, colocalizando con el citoesqueleto de actina, cuya polarización es esencial para la distribución de SSH1 en la IS. Para analizar su papel regulando la dinámica de actina, se observó el flujo de actina en células JK SSH1 KO sobre superficies activadoras, viendo una aceleración del flujo retrógrado de actina durante el escaneo de la superficie y en una ralentización durante la IS madura. Por último, se estudió la importancia de SSH1 durante la migración de los linfocitos T CD4, observando que las células SSH1 KO perdieron capacidad de penetrancia en matrices de colágeno durante la migración direccional. En DCs, la expresión de SSH1 aumentó tras la maduración, y la edición genómica con CRISPR/Cas9 mostró que SSH1 participa en la modulación de cofilina durante este proceso. El papel de SSH1 en la migración de las DCs maduras fue estudiado, observando que las células SSH1 KO presentan una menos velocidad y direccionalidad. Por último, se observó la distribución y papel de SSH1 en los podosomas de DCs inmaduras, sobreexpresando la proteína wild type o un mutante deficiente de actividad catalítica. Se pudo observar la presencia de SSH1 en los podosomas, distribuyéndose formando un anillo alrededor del núcleo de actina y en los filamentos que irradian de los podosomas. La sobreexpresión del mutante catalítico alteró la distribución de SSH1 en los podosomas, sugiriendo un papel de SSH1 en la regulación de la arquitectura del podosoma. Sobreexpresión tanto de la proteína wild type como del mutante catalítico alteró la dinámica de movimiento de los podosomas, indicando que su actividad catalítica es importante para la regulación de su dinámica.