Producción sostenible de nuevos glicoconjugados con potenciales propiedades prebióticas mediante la β-fructofuranosidasa Ffase de Schwanniomyces occidentalis

Resumen

La β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) «Ffase» de la levadura no convencional Schwanniomyces occidentalis cataliza en presencia de sacarosa reacciones de transfructosilación que suponen la formación de fructooligosacáridos (FOS) con propiedades prebióticas, siendo una de las máximas productoras conocidas de 6-kestosa. En el presente trabajo, se investigó esta habilidad transferente para la síntesis eficaz de nuevos fructoconjugados de posible interés biotecnológico. Para ello, se caracterizó la enzima Ffase en virtud de un modelo cinético no clásico y se examinó su especificidad aceptora sobre diferentes sustratos alternativos al azúcar común (el donador fructosílico), incluyendo mono-, di-y oligosacaráridos, así como glicósidos y polialcoholes. Un total de diecinuevecompuestos, en su mayoría de este último grupo, pudieron ser fructosilados con variadadinámica y eficiencia. Las incubaciones que contenían glucosa, glicerol, eritritol o manitolpermitieron generar, en condiciones máximas, 17 g/L de blastosa, 62 g/L de 1/2-O-β-D-fructofuranosil-glicerol, 35 g/L de 1/4-O-β-D-fructofuranosil-D-eritritol, y 44 g/L de 1-O-β-D-fructofuranosil-D-manitol, respectivamente. El análisis cristalográfico de los complejos deFfase inactivada con fructosil-eritritol y sacarosa contribuyó a revelar las bases molecularesde la interacción existente entre los aceptores positivos y el centro activo de estaglicosidasa. Dos pares de aminoácidos, Gln-176/Arg-178 y Gln-228/Asn-254, destacaron porsu importancia en el reconocimiento de los sustratos y la modulación de la regioselectividad.Paralelamente, se pusieron en práctica diversas estrategias para intentar optimizar ysimplificar el proceso de obtención de productos fructosilados por parte de Ffase, a saber, laevaluación de versiones enzimáticas mutadas, la catálisis por células enteras y el empleo debiodisolventes. La sustitución de secuencia N254T posibilitó conseguir el doble de cantidadde blastosa, un 31 % más de fructosil-eritritol e, incluso, trazas de 1/4-O-β-D-levanbiosil-D-eritritol. También, en menor medida, otras variantes, Q228E y S196L, conllevaron unincremento del 9 % y el 17 % en la cuantía final de, correspondientemente, fructosil-manitoly fructosil-glicerol. De manera sobresaliente, los cultivos microbianos de Schw. occidentalisoSaccharomyces cerevisiae que expresaban Ffase, ya sea nativa o mutada, pudieronsintetizar cantidades inéditas de FOS tras ser suplementados con concentracionessaturantes de sustrato directamente en el propio matraz sin necesidad de purificarpreviamente la enzima. De hecho, en este sistema, la modificación S196L logró duplicar elrendimiento final de 6-kestosa y blastosa, así como originar pequeñas proporciones de 6,6-nistosa. Por su parte, la actividad sintética de Ffase resultó asimismo compatible con oncecosolventes químicos distintos, en particular, líquidos iónicos y derivados de biomasa, todosellos ecológicos, inmiscibles en agua y extraíbles con facilidad. Un par de éteres de glicerolfluorosos, de referencia GCL17 y GCL20, mejoraron la tasa de transfructosilación de estaglicosidasa un 34 % y 40 %, respectivamente. Este efecto se correlacionó con cambiosfluorimétricos que sugerían un mayor mantenimiento de la integridad estructural proteínica