Análisis dinámico del perfil inflamatorio e inmune de pacientes con Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS)

Laburpena

Introducción: El Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS) consiste en una reacción exacerbada del sistema inmunológico ante un evento crítico, como el politraumatismo o un proceso infeccioso (sepsis). Los pacientes que desarrollan este síndrome tienen una alta probabilidad de entrar en shock y experimentar un fallo multiorgánico. Debido a la complejidad, heterogeneidad y agudeza de la respuesta inflamatoria, existe una gran falta de conocimiento sobre la fisiopatología y los principales factores reguladores de esta respuesta. Se necesitan estudios adicionales centrados en su fisiopatología. Una mayor comprensión de los factores reguladores y su importancia en la fisiopatología del SIRS podría facilitar la identificación de nuevos marcadores pronósticos y dianas terapéuticas. A pesar de los avances en el soporte y tratamiento de pacientes en la UCI, todavía existe una necesidad médica en el manejo clínico de los pacientes con SIRS. Las células mesenquimales (MSCs) están emergiendo como una terapia potencialmente atractiva para pacientes graves en la UCI debido a sus potentes propiedades inmunomoduladoras, antinflamatorias, regenerativas y de regulación de la homeostasis sistémica. Las MSCs han demostrado beneficios clínicos en varias enfermedades inflamatorias e inmunes, pero su papel en el SIRS ha sido escasamente estudiado. Objetivos: El objetivo de este proyecto de tesis doctoral fue analizar de forma multiparamétrica la respuesta de los pacientes con SIRS de distinto origen y a diferentes tiempos, con el fin de encontrar nuevos biomarcadores diferenciales de pronóstico, y evaluar in vitro el potencial inmunomodulador de las células mesenquimales a través de la interacción con los macrófagos en este contexto. Los objetivos específicos propuestos fueron: 1) Caracterizar y comparar la respuesta inflamatoria según su origen a través del estudio de múltiples poblaciones celulares circulantes y secreción de citocinas, 2) Identificar potenciales biomarcadores circulantes para conocer el pronóstico de pacientes con SIRS, 3) Cuantificar y caracterizar las vesículas extracelulares plasmáticas de los pacientes de estudio y analizar su contenido en microRNAs, y 4) Evaluar el potencial inmunomodulador in vitro de las células mesenquimales en este contexto a través de su interacción con los macrófagos. Muestras y Métodos: En diferentes momentos desde el inicio del SIRS (0, 24 y 72 horas), se tomaron muestras de sangre periférica de 25 pacientes politraumatizados (Puntuación de Gravedad de Lesiones mayor de 16) y de 25 pacientes no politraumatizados (por ejemplo, infecciones). También se estudiaron muestras de control de donantes sanos. Se registraron datos clínicos y parámetros de evolución para análisis bioestadísticos y de relación. Se calcularon puntuaciones para el pronóstico y daño en órganos como APACHE II o SOFA. A través de pasos de centrifugación, se aislaron células y plasma para diferentes análisis. La sangre (0 y 72 horas) se trató para la lisis de eritrocitos, luego se tiñeron y fijaron las células para el análisis de citometría de flujo. Se utilizó una combinación de anticuerpos conjugados diferentes para la identificación y cuantificación de subconjuntos de células mieloides y linfoides circulantes, así como otros como células progenitoras y mesenquimales. Las concentraciones plasmáticas y la cinética de múltiples alarminas, tanto citocinas proinflamatorias como antinflamatorias, quimiocinas y factores de crecimiento en 0, 24 y 72 horas se estudiaron mediante tecnología Luminex en un panel personalizado para esta condición inflamatoria. Para el aislamiento de vesículas extracelulares (VEs), se siguió un protocolo de ultracentrifugación. Después de filtrar y centrifugar el plasma, se caracterizaron las VEs precipitadas mediante microscopía electrónica de transmisión (para la determinación de la forma), Western Blot (expresión de la proteína CD63) y análisis de seguimiento de nanopartículas (para la determinación del tamaño y la concentración). Para el perfil de expresión de microRNAs a partir de las VEs, se utilizó un microarray de hasta 377 secuencias. El análisis bioinformático del contenido de microRNAs se realizó bajo el software estadístico R y se obtuvo información sobre el papel regulatorio de los microRNAs más relevantes de bases de datos específicas. Los monocitos de los sobrenadantes se aislaron con cuentas magnéticas anti-CD14 y luego se cultivaron con GM-CSF y se suplementaron (50%) con plasma de 0 o 72 horas de pacientes con SIRS o con plasma de donantes sanos. Después de 5 días, se fotografiaron y desprendieron para el análisis de inmunofenotipado, expresión de ARNm, producción de citocinas y actividad fagocítica. Además, los monocitos se cultivaron en las condiciones previas y se cocultivaron durante la noche con MSCs en insertos transwell. Después de este cultivo, se analizó la morfología de los macrófagos y su inmunofenotipo. Además, se estudió el perfil inmunorregulador de las MSCs. Los datos clínicos y los parámetros de la UCI se relacionaron con los resultados de laboratorio para identificar conexiones sólidas entre variables y la evolución del paciente. Se realizaron análisis estadísticos para comparaciones entre grupos mediante la prueba de U-Mann-Whitney. Para el estudio de la cinética o cambios con el tiempo, se realizó la prueba de Wilcoxon. Para identificar valores de corte óptimos (valores de corte) de diferentes variables, se utilizaron curvas ROC. Se realizó una agrupación visual y basada en ROC para identificar patrones específicos dentro de los grupos patológicos. Se utilizó la prueba de correlación (Spearman o Pearson) para identificar relaciones entre múltiples variables. Se empleó la curva de Kaplan-Meier para estimar la función de supervivencia según variables seleccionadas. Se utilizaron modelos de escalamiento multidimensional para agrupar las muestras en función de un conjunto específico de variables (dendrograma, PCA). Resultados: Los pacientes con SIRS presentaron una evolución clínica diferente según el tipo de insulto. Los pacientes politraumatizados mostraron una estancia más prolongada en la UCI y en el hospital, pero un número similar de fallecimientos en comparación con el grupo no politraumatizado. Los pacientes politraumatizados presentaron valores más altos de lactato, LDH y ALT, mientras que los no politraumatizados tenían valores más altos de bilirrubina, creatinina y fibrinógeno después del inicio del SIRS. En cuanto a las puntuaciones de pronóstico y daño en órganos como APACHE II y SOFA, fueron similares en ambos grupos estudiados. Además, los pacientes politraumatizados necesitaron más días de estancia en la UCI y mostraron peores valores de calidad de vida después de recibir el alta hospitalaria. La reacción del SIRS se caracterizó por un aumento en el recuento total de leucocitos debido a la liberación masiva de neutrófilos en las primeras horas del SIRS. Esto se determinó por un aumento en los subconjuntos de neutrófilos maduros e inmaduros (expresión baja de CD16). Sin embargo, hubo una reducción en los eosinófilos y basófilos. Los monocitos se mantuvieron estables, aunque las muestras de politraumatizados mostraron un aumento durante las primeras horas. Mientras que los monocitos intermedios aumentaron en comparación con los valores saludables, los monocitos no clásicos se redujeron. Respecto a la población de células supresoras mieloides derivadas (MDSC), aumentaron en los pacientes politraumatizados a las 0 horas y en los pacientes no politraumatizados después de 72 horas. Otras poblaciones de interés y menos descritas, como las células madre hematopoyéticas y las MSC, mostraron un aumento parcial durante la primera hora en los pacientes politraumatizados. Mientras en los pacientes no politraumatizados, este aumento se mostró después de 72 horas. El análisis de la expresión de ciertos marcadores indica que, durante el SIRS, la mayoría de los leucocitos aumentan los niveles de proteína CD62L (movilización celular). Además, las células presentadoras de antígenos, como los monocitos y las células dendríticas, disminuyeron en la expresión de HLA-DR. Esta proteína es crucial para la presentación de antígenos y la activación de células inmunitarias adaptativas. Todos estos resultados sugieren que el SIRS se caracteriza por una movilización rápida de neutrófilos y otras células de la médula ósea, seguida de una migración no controlada a diferentes tejidos. Además, las alteraciones específicas en el nicho hematopoyético pueden explicar la falta de reemplazo en poblaciones de leucocitos como las células T o NK. Esta movilización celular está relacionada con el aumento agudo de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento. El pico de la reacción del SIRS se alcanza durante las primeras 24 horas. Después de 72 horas, la mayoría de los niveles de citocinas eran similares a los de los plasmas saludables. Curiosamente, tanto las señales proinflamatorias como las antinflamatorias coexistieron. Este resultado indica que la respuesta del SIRS está mediada por una señalización alterada y sistémica. En términos generales, los grupos no politraumatizados presentaron concentraciones más altas de estas moléculas. Además, G-CSF y VEGF aumentaron después del inicio del SIRS, mientras que FasL (involucrado en la apoptosis) disminuyó en ambos grupos. Aparentemente, la respuesta del SIRS se caracteriza por una liberación aguda y no controlada de citocinas, un proceso conocido como hipercitocinemia. Siguiendo este patrón de inflamación, la concentración de VEs aumentó drásticamente durante el SIRS. Las partículas aisladas presentaban un tamaño de 180 nm y forma esférica y expresaban la marca CD63 clásica para VEs. Estas vesículas, como portadoras de moléculas celulares, mostraron un perfil de microRNA conservado entre los grupos, especialmente en los grupos de politraumatizados y sanos. Los pacientes no politraumatizados presentaron una gran heterogeneidad en el contenido de microRNAs. Estos resultados indican que la concentración de VEs aumenta durante el SIRS y que el perfil de microRNAs está relacionado con la condición clínica del paciente. Después de caracterizar la reacción del SIRS, intentamos reproducir las condiciones del SIRS in vitro. El plasma de pacientes con SIRS, especialmente de pacientes no politraumatizados, indujo la maduración y diferenciación de monocitos sanos en macrófagos de tipo M2 (antinflamatorios). Bajo estas condiciones, los macrófagos mostraron un aumento en las proteínas CD163 y una disminución de CD64 en la membrana. Solo con el plasma de pacientes no politraumatizados, los macrófagos secretaron valores elevados de IL-6 y mostraron menos actividad fagocítica. Este fenotipo de macrófagos presenta un importante potencial inmunomodulador y puede estar involucrado en la resolución de la inflamación. Por lo tanto, en estas condiciones críticas, los macrófagos intentarán compensar el estado inflamatorio. Siguiendo esta idea, nuestro siguiente objetivo fue saber si las MSCs sanas podrían promover la diferenciación de tipo M2 en condiciones de SIRS. Después del cocultivo de ambos tipos de células en condiciones de SIRS, las MSCs promovieron el fenotipo M2. Curiosamente, las MSCs mostraron un perfil inmunomodulador en condiciones de SIRS solo cuando los macrófagos estaban en el cultivo. Estos resultados indican que la terapia con MSCs podría favorecer la regulación de las condiciones inflamatorias a través de la interacción sinérgica con la población de macrófagos. Conclusiones: - Tanto el SIRS tras politrauma como el no politrauma presentaron un patrón de respuesta inflamatoria similar, pero siendo más grave en aquellos pacientes con origen infeccioso. Ambos grupos presentaron una mayor respuesta inflamatoria tras el inicio del SIRS y recuperaron valores parcialmente normales a las 72 horas. - En condiciones SIRS se produce una movilización masiva de neutrófilos y una disminución continuada de las poblaciones de células dendríticas y linfoides. En pacientes con politrauma se produce un aumento de monocitos, MDSCs y MSCs durante las primeras horas. - La reacción SIRS se caracteriza por una hipercitocinemia con un aumento no sólo de citocinas pro- y antinflamatorias, sino también por la liberación de potentes quimioatrayentes celulares y factores de crecimiento durante las primeras 24 horas tras el inicio del SIRS. - Valores elevados de IL-6, IL-8 y TNF¿, y el recuento bajo de monocitos al inicio del SIRS se asocian a incremento en el riesgo de infecciones en pacientes politrauma. - La concentración plasmática de IL-8 y MIF, y el número de MDSCs se relacionan con elevados valores de SOFA a las 72 horas, indicativos de una peor evolución del paciente. - En cuanto a la relación de estos parámetros con el APACHE II, los niveles de IL-8 y el recuento de MDSCs se asocian a mayor mortalidad. - Durante el SIRS se produce un aumento de la concentración de VEs en plasma siendo mayor en el grupo no politraumatizado. - El contenido de microRNAs de las VEs está directamente determinado por el origen del SIRS. - La exposición al plasma del SIRS de monocitos sanos induce su diferenciación a macrófagos con fenotipo antinflamatorio (M2), especialmente en condiciones de SIRS no politrauma. - Las MSCs mostraron una actividad sinérgica con los macrófagos promoviendo el perfil M2.