Applications of CRISPR/Cas technology and nanovehicles in the edition and detection ofpathogenic mutations

Resumen

La tecnología CRISPR/Cas ha revolucionado la edición génica. Las nucleasas CRISPR componen un conjunto de versátiles herramientas que ya se ha empleado para la generación de knock-in y knockout, edición de bases y modulación transcripcional. Además, algunas proteínas Cas, como Cas12a, poseen una actividad trans adicional que puede utilizarse para detectar ácidos nucleicos. El sistema CRISPR/Cas resulta, por tanto, muy prometedor tanto para el tratamiento como para el diagnóstico de numerosas enfermedades. Este proyecto, centrado en las nucleasas Cas12a y Cas9, explora ambos aspectos. Los trastornos genéticos son la diana principal de las terapias CRISPR. Se trata de un grupo heterogéneo de enfermedades que provocan elevada mortalidad y morbilidad a nivel mundial. La capacidad de las nucleasas Cas para cortar el ADN de manera específica allana el camino para la modificación selectiva de las alteraciones causantes de dichos trastornos. Esta modificación puede ocurrir a través de dos vías diferentes de reparación del ADN que se activan tras el corte: la unión de extremos no homólogos y la reparación dirigida por homología. La primera puede aprovecharse para interrumpir la expresión de genes patógenos, mientras que la segunda permite editar genes de manera precisa, lo que puede emplearse para corregir mutaciones patógenas. En esta tesis, hemos explorado el potencial terapéutico de ambas vías, centrándonos especialmente en el problema de la entrega de proteínas CRISPR. Para ello, el primer paso ha sido implementar un protocolo para la purificación de Cas12a y Cas9, así como una serie de ensayos para validar su actividad nucleasa tanto ex cellullo como in cellullo. Existen varios métodos para la entrega de proteínas CRISPR in vitro y ex vivo. Sin embargo, la mayoría de aplicaciones terapéuticas requieren entrega in vivo y, en este sentido, la membrana citoplasmática y el atrapamiento endosomal constituyen importantes barreras. Para abordar este reto, hemos empleado dos estrategias complementarias. Por un lado, hemos diseñado diferentes variantes de Cas12a para evitar el atrapamiento endosomal. Por otra parte, dado que el transporte de proteínas libres suele ser ineficiente, hemos optimizado un protocolo para la interacción de las proteínas Cas12a y Cas9 con nanopartículas magnéticas (MNP). Los nanomateriales se han utilizado ampliamente como vehículos para una gran variedad de biomoléculas. Entre ellos, las MNP resultan especialmente atractivas por su seguridad y versatilidad. Sin embargo, hasta donde sabemos, su potencial para la entrega de proteínas CRISPR no se ha explorado aún. Utilizando esta estrategia de nanoentrega hemos sido capaces de generar knockouts mediados por Cas9 y Cas12a en diferentes modelos celulares. Por último, hemos explorado el uso de Cas12a para la detección de ácidos nucleicos. En concreto, se ha aprovechado la actividad trans de Cas12a para la detección de mutaciones asociadas a melanoma de úvea en muestras de biopsia líquida. El diagnóstico precoz y el seguimiento de la enfermedad son claves para mejorar la supervivencia de los pacientes de melanoma de úvea. Además, el hecho de que la mayoría de los pacientes presenten mutaciones en el codón Q209 de GNAQ y dichas mutaciones raramente se encuentren en otros tumores, hace de este cáncer un candidato ideal para la detección de ácidos nucleicos. En este trabajo hemos diseñado una aproximación basada en Cas12a para la detección específica de GNAQ mutante. El acoplamiento de dicha detección a la amplificación de ácidos nucleicos ha permitido detectar la mutación con alta especificidad y sensibilidad en muestras de plasma de pacientes de melanoma de úvea, lo que demuestra su aplicabilidad clínica para biopsia líquida.