Respuesta farmacológica y estudio funcional de los canales KATP con mutaciones asociadas al Síndrome de Cantú

Resumen

El Síndrome de Cantú (SC) es una enfermedad rara causada por mutaciones en los genes que codifican las subunidades Kir6.1 (KCNJ8) y SUR2A (ABCC9) de los canales KATP. Estos canales son bloqueados por concentraciones fisiológicas de ATP, por tanto, conectan las actividades metabólica y eléctrica en los múltiples tejidos en los que se expresa. Las mutaciones disminuyen la sensibilidad del canal por el ATP por lo que aumentan la densidad de la corriente (IKATP). Se ha propuesto que la glibenclamida, un fármaco bloqueante de los canales KATP, podría ser una opción terapéutica para estos pacientes. La glibenclamida se une a los dos sitios descritos de unión a sulfonilureas de los canales KATP (A y B) sin embargo, hay fármacos que bloquean el canal uniéndose exclusivamente al sitio A (ej. gliclazida) o B (ej. repaglinida). Nuestra primera hipótesis es que la glibenclamida puede no ser útil en todos los pacientes, dado que el bloqueo de los canales KATP dependerá de la subunidad en la que esté presente la mutación y su localización. Por otro lado, se ha descrito que la gravedad del fenotipo de los pacientes con SC varía en función de la mutación de la que son portadores aceptándose que cuanto más afecta a la unión del ATP más grave es el fenotipo. Sin embargo, existen datos que ponen en duda este axioma. Así, la mutación SUR2A p.S1054Y, considerada de alta patogenicidad por ser una de las que más reduce la sensibilidad del canal por el ATP, da lugar a un fenotipo leve en los pacientes portadores. Nuestra segunda hipótesis es que la intensidad de los fenotipos de los pacientes con SC es modulada por mecanismos adicionales no identificados. Por ello, nuestro segundo objetivo fue realizar un análisis funcional de las alteraciones producidas por esta mutación. Para llevar a cabo el primer objetivo, se registró la IKATP utilizando la técnica de patch-clamp en configuración de whole-cell en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de los diferentes fármacos. Se demostró que la mutación Kir6.1 p.V65M y SUR2A p.R1154Q (que forman parte del sitio B y A, respectivamente) reducen significativamente el efecto de la glibenclamida, sin embargo, no se observaron cambios significativos en la respuesta a la gliclazida y repaglinida, respectivamente. Por tanto, el análisis farmacológico de esta Tesis Doctoral indica que en pacientes con mutaciones que afectan al sitio A el tratamiento más adecuado sería la repaglinida, mientras que para los que presentan mutaciones que afectan al sitio B, sería la gliclazida. Para el análisis funcional de la mutación SUR2A p.S1054Y se registraron las corrientes generadas mediante patch-clamp en configuración de whole-cell. Se demostró que la mutación aumenta la densidad de la IKATP. Para identificar el mecanismo biofísico responsable de este efecto, se registraron las corrientes generadas por un único canal KATP mediante patch-clamp en configuración de cell-attached. Estos experimentos demostraron que la mutación aumenta significativamente la frecuencia y la probabilidad de apertura del canal, así como su conductancia induciendo, además, la aparición de estados subconductores. Sin embargo, se observó que la mutación también produce un efecto de pérdida de función al reducir la expresión de las subunidades SUR2A y Kir6.2 en la membrana celular, lo que podría compensar parcialmente el marcado aumento de la IKATP, y explicar el leve fenotipo de los pacientes portadores. Nuestros resultados nos permitieron demostrar que la sobre-expresión de la proteína de anclaje anquirina B (AnkB) corrige los efectos de pérdida y ganancia de función de los canales KATP que produce la mutación. Además, se observó que la AnkB restituye la afinidad de los canales mutados por el ATP con experimentos de patch-clamp en configuración de inside-out. Finalmente, mediante un ensayo de doble híbrido en levaduras, demostramos en primicia que la AnkB también interacciona con SUR2A y que la mutación p.S1054Y impide dicha interacción