Structure and function investigation on membrane-binding proteins

Resumen

Esta Tesis investiga la interacción de diversas proteínas integrales de membrana con varios modelos in vitro de membranas lipídicas. Mediante el control de la composición de los modelos ha sido posible imitar membranas biológicas de interés, empleándose para ello modelos en forma de monocapas, bicapas soportadas sobre soportes sólidos y liposomas, cada una de las cuales se caracterizó adecuadamente antes de realizar los estudios de asociación y estructurales incluyendo las proteínas. La organización de las proteínas en las membranas y su interacción con los lípidos son esenciales para que se produzca una plétora de reacciones biológicas fundamentales, como el tráfico, la señalización, las vías de endocitosis y la infección viral. Las proteínas específicas son capaces de unirse a las membranas celulares, generalmente mediante una interacción electrostática o hidrofóbica. El Capítulo 1 de la tesis ofrece una introducción sobre los sistemas investigados. El Capítulo 2 describe brevemente las membranas modelo utilizadas. Los Capítulos 3 y 4 discuten la caracterización de membranas modelo constituidas exclusivamente por lípidos. Los Capítulos comprendidos entre el 5 y 7 muestran los resultados relativos a la interacción lípido-proteína. El Capítulo 8 presenta un resumen las conclusiones más relevantes obtenidas en esta tesis. Cada capítulo de este manuscrito aborda una actividad de investigación única, las cuales se centran en dos líneas: (1) la interacción de proteínas implicadas en endocitosis mediada por clatrina con membranas que contienen PIP2; (2) la interacción de péptidos de la proteína Spike del SARS- CoV-2 con modelos de membranas plasmáticas. La endocitosis mediada por clatrina (CME) es el principal mecanismo por el que las células eucariotas internalizan y reciclan la mayoría de las proteínas de membrane, estando controlada por diferentes proteínas adaptadoras y moduladoras, que interactúan únicamente con la capa interna de la membrana celular, cargada negativamente. En efecto, esta última presenta lípidos cargados negativamente, como el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2), que pueden interactuar con las regiones de carga positiva de las proteínas implicadas en las endocitosis, esto es posible porque el grupo de cabeza polar del PIP2 contiene un anillo de inositol poliol cuyos grupos hidroxilos en posición 4 y 5 están fosforilados, proporcionando así las cargas negativas necesarias para la unión con las proteínas. Se ha llevado a cabo la caracterización de un modelo de membrana plana que contiene PIP2, estudiando la orientación de dicho anillo de inositol, así como su correlación con la formación de dominios de PIP2. Además, se emplearon técnicas de caracterización de interfases y de disoluciones para investigar el proceso de asociación y las estructuras resultantes formadas por las proteínas adaptadoras CALM y AP2, y las proteínas moduladoras FCHo2 y Eps15, al asociarse con modelos in vitro de membranas enriquecidos en PIP2. El SARS-CoV-2 es un virus envuelto responsable de una enfermedad respiratoria letal desde su aparición a finales de 2019. Se caracteriza por una envoltura lipídica con proteínas de membrana, como las proteínas Envelope, Membrane y Spike, responsables del reconocimiento de receptores. Además, el dominio de fusión de la proteína Spike, que podría dividirse en componentes denominados Péptidos de Fusión (PF), desencadena la fusión entre la membrana viral y la de las células hospedadoras, dando lugar al inicio la infección. Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan la fusión de membranas no se conocen en profundidad. Tras la identificación y caracterización de membranas modelo adecuadas que pudieran replicar la membrana plasmática, se estudió la interacción de los PFs con dichos modelos, en forma de monocapas, bicapas y liposomas. En particular, las técnicas de caracterización de interfases permitieron identificar un modelo molecular detallado para el mecanismo de fusión de membranas.