Relación estructura-función de la proteína humana SP-BN derivada del precursor de la SP-B en el sistema de surfactante pulmonar

Abstract

La proteína SP-BN, perteneciente a la familia de las saposinas (SAPLIPs) deriva del extremo amino-terminal de precursor de la proteína del surfactante B. SP-BN presenta, en humanos, un sitio potencial de N-glicosilación asociado al polimorfismo de secuencia 1580 C/T, de tal manera que el alelo de referencia C1580 da lugar a T131 y por tanto a la glicosilación de N129, mientras que el alelo alternativo T1580 da lugar a I131 perdiendo el sitio de glicosilación. SP-BN ha sido caracterizada por su posible papel de defensa en el alveolo y por su presunta participación en la síntesis de las películas precursoras del surfactante. Sin embargo, toda la información referida a esta proteína procede de una versión recombinante con la secuencia murina, no glicosilada. Por todo ello, el objetivo principal que perseguía esta Tesis fue comparar los resultados publicados en cuanto a estructura y función se refiere, con la versión humana de la proteína (hSP-BN), buscando también el estudio del papel de la glicosilación. Para ello, se optimizó la producción y purificación de la proteína recombinante en sus dos versiones, glicosilada (hSP-BN) y sin glicosilar (hSP-BN-T73I) a partir del sistema eucariótico P. pastoris, obteniéndose lotes de proteína pura y con un elevado rendimiento. La caracterización estructural de hSP-BN y hSP-BN-T73I reveló una organización dimérica, los tres puentes disulfuro formados y un alto contenido helicoidal, propio de las SAPLIP. Por otro lado, se profundizó en su mecanismo molecular a diferentes pH en cuanto a su interacción con lípidos y proteínas del surfactante pulmonar, así como diferentes patógenos. Para ello, se caracterizaron las propiedades interfaciales de las proteínas hSP-BN y hSP-BN-T73I a pH ácido y pH neutro. Además, se caracterizó la habilidad de ambas para establecer interacciones con una monocapa de lípidos preformada que mimetiza la composición del surfactante pulmonar, sin llegar a insertarse en la monocapa a los dos pH, sugiriendo su interacción con las películas del surfactante una vez que es secretada a la hipofase alveolar. Se corroboró su capacidad para interaccionar y perturbar liposomas de la misma composición, estando potenciada su actividad en presencia de la proteína SP-B. La dependencia del pH en estos ensayos fue muy acusada, indicando la predominancia de interacciones de tipo electrostático favorecidas a pH ácido, tal y como se había visto para la proteína de origen murino. La presencia de la proteína SP-B en los ensayos de mezcla lipídica potenció ese efecto para la variante no glicosilada, hSP-BN-T73I, sugiriendo que la presencia de esta modificación podría impedir la acción coordinada de ambas proteínas durante la formación de los cuerpos lamelares a pH ácido. Las proteínas hSP-BN, solas o en combinación con la proteína SP-A, no presentaron una actividad antimicrobiana frente a los patógenos estudiados. Sin embargo, sí se caracterizó la interacción a pH neutro entre hSP-BN y SP-A, solas o en combinación con LPS, estando más favorecida en ausencia de la glicosilación. Estos resultados apoyan la participación de hSP-BN en funciones relacionadas con la defensa y homeostasis del alveolo. Finalmente, se propuso, mediante un estudio preliminar, la posible actividad antiviral de hSP-BN. Para concluir, la presente Tesis Doctoral corrobora el posible papel de la proteína hSP-BN en la biogénesis del surfactante, no siendo tan evidente su actividad antimicrobiana. Con esto, los resultados presentados proporcionarían una visión ligeramente diferente o más amplia sobre su función en la hipofase alveolar, pudiendo interaccionar con diferentes elementos (lípidos del surfactante, SP-A o LPS) teniendo implicaciones en la fisiología respiratoria. Esto, además, parece estar impedido para el fenotipo glicosilado de la proteína lo que podría estar relacionado con el peor pronóstico en enfermedades respiratorias observado para esa variante alélica.