Identificación, evaluación y caracterización de posibles factores de virulencia de neospora caninum / identification, evaluation and characterisation of potential neospora caninum virulence factors

Resumen

Neospora caninum es el agente etiológico de la neosporosis bovina, una de las principales causas de aborto bovino, ocasionando importantes pérdidas económicas. Tras la infección en hembras gestantes se puede producir el aborto, el nacimiento de terneros sanos, o el nacimiento de terneros congénitamente infectados. La patogenia de la enfermedad es compleja y depende de múltiples factores, siendo la virulencia del aislado implicado un factor clave. Se ha demostrado una elevada variabilidad intraespecífica en el comportamiento in vitro y la virulencia in vivo, estableciéndose correlación entre determinados fenotipos in vitro (mayor invasión y proliferación) y la virulencia en modelos murinos gestantes. Además, las comparaciones proteómicas y transcriptómicas entre aislados de distinta virulencia han revelado diferencias en la abundancia/expresión de un conjunto de proteínas/genes. Aquellas con mayor abundancia en los aislados de alta virulencia podrían considerarse posibles factores de virulencia. En este contexto, el objetivo general de la tesis fue la identificación y caracterización de posibles factores de virulencia de N. caninum, para lo que se establecieron dos objetivos. El primer objetivo fue el análisis del proteoma de taquizoíto de un amplio número de aislados mediante LC-MS/MS, comparando entre los aislados de alta y baja virulencia. Los aislado de alta virulencia mostraron una mayor abundancia de proteínas implicadas en el metabolismo energético y en el procesamiento del ADN/ARN, lo que podría determinar las mayores tasas de crecimiento. Entre las proteínas más destacadas figuran una proteína de las roptrias de la familia ROP20, la pseudoquinasa 1 de bradizoíto y varias proteínas de gránulos densos. El segundo objetivo fue la caracterización del papel de las proteínas NcGRA7 y NcROP40 en la virulencia de N. caninum. Dichas proteínas mostraron mayor abundancia en aislados de alta virulencia en previos estudios y desempeñan un papel importante en el ciclo lítico. Además, muchos de los factores de virulencia descritos pertenecen a la familia GRA y ROP. En primer lugar, se generaron mutantes defectivos en dichas proteínas mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Posteriormente, se realizaron infecciones a mitad de gestación en un modelo de ratón BALB/c. La deleción de NcGRA7 y NcROP40 se asoció con una reducción de la virulencia ya que las madres infectadas con dichas cepas mostraron menores tasas de mortalidad y morbilidad y menores cargas parasitarias que las infectadas con la cepa parental. El tiempo medio de supervivencia de las crías de los animales infectados con las cepas deficientes fue significativamente mayor, siendo el grupo infectado con la cepa deficiente en NcGRA7 el que registró el mayor tiempo medio. Finalmente, para profundizar en el papel de dichas proteínas en su hospedador natural se realizó la caracterización de las cepas deficientes en dos modelos in vitro utilizando células diana bovinas: trofoblasto (línea F3) y macrófagos (boMØ). La capacidad de proliferación de los mutantes defectivos fue similar a la de la cepa parental en las células F3, tanto en la cinética de crecimiento como en el ensayo de competición, sugiriendo que, una vez los parásitos defectivos hubieran alcanzado la placenta, serían capaces de multiplicarse en el trofoblasto bovino y transmitirse al feto. Sin embargo, en boMØ se observó una disminución de la proliferación de las cepas deficientes a las 48, 60 y 72 horas postinfección. La estimulación de boMØ con IFN-¿ mostró una inhibición similar del crecimiento de los taquizoítos en todas las cepas de forma dosis-dependiente. Por último, los boMØ infectados con cepas deficientes mostraron mayores niveles de expresión del receptor TLR3, por lo que podrían ser más fácilmente reconocidos y eliminados. Palabras clave: Neospora caninum, virulencia, proteómica, CRISPR/Cas9, trofoblasto bovino, macrófagos bovinos.