Comportamiento "in vitro" de alelos recombinantes del gen de la miostatina para su aplicación en producción animal

Résumé

La miostatina es un miembro de la familia de los Factores de Crecimiento y Transformación (TGFbeta) responsable de la inhibición del desarrollo de la masa muscular. El ganado bovino con mutaciones inactivantes en la miostatina presenta un considerable aumento de su masa muscular conocido como hipertrofía muscular o cularidad. Este incremento muscular está acompañado de una disminución igualmente considerable de la cantidad de grasa que se traduce en un claro incremento del valor económico de sus canales. El aumento del conocimiento de la estructura y función de la miostatina ha puesto en marcha el desarrollo de metodologías destinadas a manipular su funcionamiento o evitar los efectos indeseados asociados al fenotipo culón. En la primera línea de investigación seguida en esta tesis se ha planteado crear un sistema que permita estudiar la reversbilidad del fenotipo hipertrófico a fenotipo normal. Para ello se ha realiz ado la construcción de un sistema "Mstn OFF to ON". En este sistema el tercer exón de la miostatina está en posición invertida pero es susceptible de volver a la posición permanentemente activa mediante el sistema Cre/lox, utilizando una variante de lox mutados. Este sistema se ha probado in vitro y en un sistema bacteriano, en los que se ha demostrado su capacidad de pasar de una configuración inactiva a una activa, manteniéndose además en este último estado. Por el contrario, cuando se realizó una integración estable por recombinación homóloga en células ES murinas, no se consiguió revertir a la configuración activa, probablmente debido a la utilización de un promotor demasiado débil para que la expresión de la Cre-recombinasa resultara adecuada ante los lox mutados utilizados. Aunque esta línea de investigación se ha interrumpido en este punto, estos resultados apuntan hacia la posibilidad de utilizar vectores de Cre más aptos para lograr la recombinación esperada entre lox mutados. La segunda línea de estudio de esta tesis ha consistido en la creación y evaluación de distintos alelos de la miostatina potencialmente dominantes negativos. El fenotipo culón típico sólo se presenta en estado de homocigosis; por ello es indudable el interés zootécnico de obtener terneros heterocigotos culones en cruces industriales, así como la posible aplicación postnatal de estos alelos para eliminar los efectos perinatales asociados al fenotipo culón. Así, se han planteado tres alelos dominantes negativos potencialmente capaces de anular la función de la miostatina salvaje en su presencia. Estas tres variantes se han diseñado de modo que se impida su unión al receptor específico de membrana por impedimiento estérico. Dado que esta estrategia de dominancia negativa depende básicamente de la capacidad de dimerización entre monómeros salvajes y monómeros mutantes se han realizado dos ensayos de iteracción para confirmar que la unión entre monómeros no se ha visto alterada. Estos ensayos confirmaron que las tres variantes dominantes negativas diseñadas son perfectamente capaces de formar dímeros con los monómeros salvajes, y además, que esta unión no es significativamente diferente de la unión existente entre dos monómeros salvajes. Por lo tanto, los alelos diseñados cumplen el primer requisito imprescindible en una estrategia de dominancia negativa.