Identificación y cuantificación de especies en productos alimenticios mediante PCR en tiempo real

Zusammenfassung

La verificación de las especies animales y vegetales presentes en productos alimenticios mediante métodos analíticos es una necesidad creciente para la industria alimentaria y los organismos de control oficiales. La detección de sustituciones de especies de alto valor por otras de precio inferior en productos alimenticios, la verificación de los porcentajes de cada especie declarados en el etiquetado y la detección de especies no autorizadas son, entre otros, algunas de las aplicaciones de los métodos moleculares de identificación y cuantificación de especies en alimentos. En esta tesis se han abordado diferentes aspectos de las técnicas para la detección y cuantificación de especies basadas en la amplificación en tiempo real de secuencias de DNA específicas. En primer lugar, se ha diseñado y ensayado un método basado en sondas TaqMan® MGB (Minor Groove Binding) genéricas y cebadores específicos para DNA mitocondrial de varias especies cárnicas: vaca (Bos taurus), cerdo (Sus scrofa), pollo (Gallus gallus) y pavo (Meleagris gallopavo). Además, se propone un nuevo método de cálculo que permite detectar la presencia de DNA de otras especies eucarióticas en la muestra cuando se encuentran en porcentajes mayores del 20%. Este amplicón general para organismos eucariotas también se utiliza para normalizar los valores obtenidos con los amplicones específicos, posibilitando la cuantificación de muestras que contienen mezclas de materiales procedentes de diferentes especies, siguiendo un método basado en el número de ciclo en el que se alcanza una fluorescencia umbral. Puesto que el procesado de los alimentos es algo habitualmente usado con objeto de conservar y preparar los alimentos, en un trabajo experimental posterior se ha estudiado la forma en la que el tratamiento de calor y el tiempo de exposición pueden afectar al DNA y llegar a ser una causa de error en los análisis cualitativos y cuantitativos. Los detectores diseñados para vaca y cerdo se utilizaron en este caso para verificar el contenido de cada especie en mezclas de carne sometidas a tratamientos con calor. En una segunda aproximación, se diseñaron nuevos detectores para analizar la fragmentación de la cadena DNA en las carnes tratadas a partir de las amplificaciones obtenidas con cebadores separados en 95, 250 y 350 pares de bases en muestras de carne sometidas a diversos tratamientos de cocción y esterilización. Comparando los resultados con los obtenidos utilizando DNA tratado con diferentes concentraciones de DNasa I fue posible establecer una correlación entre los tratamientos térmicos y el grado de fragmentación del DNA.