Estudio e interés biotecnológico de una esterasa versátil producida por un hongo del azulado de la madera

Resumen

Las lipasas y esterasas son biocatalizadores versátiles y el tipo más utilizado de enzimas para fines biotecnológicos. El hongo Ophiostoma piceae produce un esterol esterasa (OPE) con alta afinidad sobre triglicéridos y ésteres de esterol siendo capaz de hidrolizar eficazmente mezclas naturales de estos compuestos a partir de extractos de madera. Debido a estas propiedades, se ha propuesto el uso de esta enzima para disminuir el problema de la deposición de pitch en la fabricación de pasta de madera procedente de coníferas y frondosas. La secuencia de la proteína madura de la OPE se ha expresado con éxito en cepas Mut+ y Muts de Pichia pastoris, que difieren en su capacidad de metabolizar metanol como inductor de la expresión, dando como resultado niveles más altos de actividad que los obtenidos en cultivos en Erlenmeyer de O. piceae. Además, la producción de la enzima recombinante (OPE*) se escaló a biorreactor operando en discontinuo y discontinuo-alimentado utilizando ambas cepas. En todas las condiciones ensayadas los niveles de actividad fueron mayores que los obtenidos previamente en matraz Erlenmeyer, alcanzando la actividad máxima (30 U/ml) con la cepa Muts operando en una estrategia con sorbitol como co-sustrato durante cultivo en discontinuo alimentado. La caracterización cinética de la proteína recombinante mostró una enzima mejorada con una eficacia catalítica aparente más elevada que la enzima nativa (unas 8 veces) para todos los sustratos ensayados (ésteres de p-nitrofenol, glicerol y colesterol). Ni el mayor nivel de N-glicosilación ni la presencia de residuos de metionina oxidados en la región de unión al sustrato de OPE* parecen ser responsables de esta mejora. Estudios de dicroísmo circular mostraron cambios en sus espectros, pero el análisis de los datos (método K2d de DichroWeb) dio como resultado un contenido idéntico en hélices alfa (0,46) y láminas beta (0,23) para ambas proteínas indicando la ausencia de cambios en su estructura secundaria. Ahora bien, la principal diferencia en ellas se encontró en la secuencia N-terminal de la OPE* que contenía 6-8 residuos más que OPE. Estos residuos procedían del vector utilizado para la expresión de la proteína y del procesamiento ineficiente del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae utilizado para la secreción. Esto afecta al estado de agregación detectado en OPE* (inferior a la descrita en OPE) lo que mejora su eficiencia catalítica. Dado su potencial, se han estudiado nuevas aplicaciones biotecnológicas para esta enzima: i) desacetilación de acetato de polivinilo (PVAc), uno de los compuestos identificados en los stickies formados durante la producción de papel reciclado. La capacidad de la enzima para realizar tal reacción ha sido confirmada mediante espectroscopía de FTIR, análisis de espectrometría de masas y titulación; de modo que, los resultados obtenidos, en las condiciones de ensayo, muestran una actividad semejante a la de la enzima Optizyme(R)530 comercializada para este fin. ii) Síntesis de ésteres en medios orgánicos, concretamente de ésteres de fitoesterol, como productos nutracéuticos. En este caso, la influencia de la concentración de enzima y sustrato y el efecto de diferentes disolventes orgánicos junto a la presencia y ausencia de agua en las reacciones han sido estudiados. Los resultados obtenidos han permitido patentar el empleo de la enzima para tal fin al ser semejantes a los alcanzados con la enzima comercial de C. rugosa empleada en la comparación e incluso algo mejores en algunas circunstancias. Se observó un total de producción de ésteres de esterol del 60 por ciento en 24 horas cuando se usó un pequeño exceso de sustrato aumentando al 80 por ciento con excesos mayores.