Interacción sorbatos-levaduras en alimentosmodelización de su efecto en medio sólido, biología molecular y detección de su transformación en 1,3-pentadieno por mwir

Resumen

Los sorbatos son conservantes susceptibles de ser convertidos por microorganismos en el compuesto maloliente 1,3-pentadieno. Su producción se ha estudiado principalmente en hongos y en la levadura S. cerevisiae y no existen técnicas baratas en las industrias para detectarlo. Los alimentos en los que se ha descrito su presencia son la mayoría sólidos, donde el crecimiento microbiano difiere respecto a líquidos, haciendo poco fiable extrapolar los datos de uno a otro. Por ello, los objetivos generales de esta Tesis son: 1) Modelización del crecimiento superficial de levaduras sobre medios sólidos y su aplicación al efecto inhibidor del sorbato potásico. 2) Análisis molecular de la producción de 1,3-pentadieno en las levaduras D. hansenii y Z. rouxii. 3) Utilización de un detector basado en espectroscopía de infrarrojo medio (MWIR) para detectar gases responsables del deterioro por levaduras de alimentos. Hemos observado que tras el crecimiento exponencial, existen diferencias entre la cinética de crecimiento de células viables en medio sólido (YMA) y en medio líquido (YMB). En sólido se da una disminución progresiva de µ hasta alcanzar una fase pseudoestacionaria con aún crecimiento en tamaño. El desarrollo de rutinas de análisis de imagen permitió obtener de forma ventajosa parámetros coloniales. Proponemos el modelo exponencial combinado con una adaptación del modelo de Gompertz para describir el crecimiento de células viables en la colonia; una ecuación de Gompertz para el crecimiento en radio o área y el área como parámetro indirecto del número total de células. Este modelo se aplica con éxito a datos de varias especies de levaduras. Su uso en el efecto inhibidor del sorbato sobre el crecimiento de levaduras en medios sólidos permitió establecer y cuantificar que sus efectos son similares a los descritos en líquido: disminución inicial de µ cuya prolongación e intensidad depende de la especie, junto a una disminución de la biomasa. Además detectamos que las cepas pueden adaptase y alcanzar lentamente los mismos valores de biomasa final que sin conservante, a tener en cuenta al calcular la sensibilidad/tolerancia en medio sólido. La detección de 1,3-pentadieno se realizó mediante una prueba rápida sensorial a pH 7 y 0,75 g/l de sorbato potásico y en esas condiciones Debaryomyces lo produce en mayor cantidad que S. cerevisiae y Z. rouxii. En D. hansenii y Z. rouxii hemos detectado secuencias nucleotídicas con más de un 60% de identidad con los genes PAD1 y FDC1 que codifican las enzimas responsables del proceso descritas en S. cerevisiae. Las secuencias PAD1 carecen de un polimorfismo relevante, pero en D. hansenii, la incapacidad de producir 1,3-pentadieno se debe a deleciones comunes de un único nucleótido que generan un codón STOP que impide sintetizar la proteína Fdc1. Los polimorfismos comunes del gen FDC1 permitieron diseñar un protocolo de PCR que detecta cepas de D. hansenii productoras de 1,3-pentadieno. En Z. rouxii no encontramos mutaciones en ambos genes que expliquen la incapacidad de algunas cepas de generarlo. Para detectar precozmente la producción de 1,3-pentadieno se ha empleado un detector MWIR (3-4,6 ¿m) con un dispositivo para confinar gases. Se han grabado espectros dinámicos de los gases del espacio de cabeza de cultivos de levaduras y se les ha aplicado un análisis quimiométrico: un análisis de componentes principales que aportaba información en 3,1-3,4 y 4,1-4,3 µm donde absorben los enlaces del 1,3-pentadieno y CO2 producidos; un análisis de clúster que diferenciaba cultivos muy productores de CO2 y los que habían producido 1,3-pentadieno; y un análisis discriminante que clasificó todas las muestras en función de la presencia o no de 1,3-pentadieno. Tras validarlo, el dispositivo MWIR podría ser usado como una alternativa barata, no destructiva y automatizable para detectar muestras afectadas por este tipo de deterioro y producción de CO2 durante la línea de producción/distribución de los alimentos.