Aplicación de las técnicas "ómicas" en la búsqueda de genes implicados en patologías alérgicas asociadas a la infección por "Anisakis simplex" s.l.

Resumen

El diagnóstico y conocimiento de las entidades clínicas asociadas a la infección por A. simplex s.l. ha aumentado considerablemente en los últimos años. Sin embargo, hay aspectos relacionados a la peculiaridad de su naturaleza todavía sin resolver. Además, existe una conocida comunidad antigénica entre genes de nematodos y artrópodos, así como alergenos responsables de reacciones cruzadas aún por caracterizar. En la presente memoria se propuso la búsqueda, identificación y caracterización molecular de nuevos alergenos, teóricos y demostrados experimentalmente, de la larva 3 de A. simplex s.l. a través de la aplicación de técnicas ómicas. Para la predicción in silico de alergenos putativos del parásito, se procedió a sintetizar, secuenciar, ensamblar y anotar el transcriptoma de la L3 de A. simplex s.l., se realizaron dos ensamblados del transcriptoma, un ensamblaje de novo, y posteriormente un ensamblaje de novo guiado por referencia del genoma de A. simplex s.l. publicado por el Instituto Sanger. La predicción de las proteínas potencialmente alergénicas se efectuó mediante comparación de una base de datos creada a partir de la predicción de las proteínas de ES de A. simplex s.l., obtenidas de la información del transcriptoma, con los alergenos presentes en las siguientes tres bases de moléculas alergénicas, Allergome, Allermatch y FARRP. De este modo, se predijeron un total de 24 alergenos pertenecientes a 13 familias, según la clasificación de familias de alergenos AllFam. Algunos de estos alergenos putativos pertenecían a familias muy importantes, como la familia de tioredoxinas o la mano EF. Además, otros alergenos identificados como las disulfuro isomerasas, proteínas de choque térmico, proteínas del veneno de himenópteros y proteínas D7, presentaban similitud con moléculas en otros nematodos, insectos y crustáceos, lo que indicaría su posible implicación en reacciones cruzadas. La búsqueda y caracterización de alergenos identificados experimentalmente se realizó por inmunocribado asociado a las técnicas de proteómica, basadas en espectrometría de masas, combinado con aproximaciones bioinformáticas. Los productos de ES de L3 de A. simplex s.l. se utilizaron como fuente de antígenos. Para el inmunocribado se emplearon sueros de 4 grupos de pacientes seleccionados según criterios clínicos y analíticos como anisakiosis gastroalérgica, urticaria crónica asociada a sensibilización a Anisakis spp., anisakiosis digestiva y sensibilización subclínica. Así, se identificaron 12 nuevos alergenos, comprobando el reconocimiento diferenciado de alergenos según las entidades clínicas estudiadas. Los pacientes aquejados de AGA mostraron el patrón de inmunorreconocimiento más intenso y ATP1 fue el alergeno más inmunorreactivo en todos los grupos de pacientes alérgicos estudiados; ATP1 podría ser uno de los alergenos inductores de las reacciones alérgicas asociada a la infección por A. simplex s.l., además, se plantea su posible papel en las reacciones cruzadas entre A. simplex s.l. y el veneno de los véspidos. Finalmente, se llevó a cabo la caracterización molecular de los genes de los alergenos principales Ani s 7 y Ani s 14, cuyas secuencias estaban incompletas a pesar de su alto potencial diagnóstico. El análisis in silico y el uso de herramientas de biología molecular sugieren que Ani s 7 es un miembro de una familia multigénica, que incluye distintas copias de la molécula, así como 3 genes parálogos. El estudio detallado de las secuencias de Ani s 7 y Ani s 14 revela la presencia de múltiples epitopos de unión a IgE explicando su alta sensibilidad diagnóstica por lo que la selección de las repeticiones más idóneas, permitirá la expresión de las mismas como proteínas recombinantes para su uso en el diagnóstico de los procesos alérgicos asociados a la infección por A. simplex s.l.