Control de "Clostridium" spp. Y prevención de hinchazón tardía en queso mediante bacterias lácticas productoras de antimicrobianos, altas presiones y endolisinas fágicas/

Resumen

La hinchazón tardía del queso, o fermentación butírica, es una alteración de origen microbiano que se produce en quesos curados y semicurados debido al crecimiento en el interior del queso de algunas especies del género Clostridium capaces de fermentar el ácido láctico con producción de ácido butírico, ácido acético, dióxido de carbono e hidrógeno. Como resultado se originan defectos de textura, aroma y sabor en el queso que imposibilitan su comercialización. La adición de nitratos o lisozima a la leche es empleada para el control de Clostridium, pero estos aditivos presentan ciertos riesgos sanitarios y, pese a su uso, los quesos se siguen hinchando. En esta Tesis Doctoral se ha evaluado el empleo de bacterias lácticas productoras de los antimicrobianos, nisina o reuterina, la aplicación de altas presiones y el empleo de endolisinas fágicas como estrategias alternativas al uso de estos aditivos para prevenir la hinchazón tardía causada por Clostridium spp. en el queso. Además, se ha estudiado el efecto de las estrategias que resultaron eficaces sobre las características microbiológicas, físico químicas y sensoriales del queso, y la aplicación de endolisinas fágicas para detectar Clostridium spp. En primer lugar se estudió el grado de implicación de distintas especies de Clostridium en la hinchazón tardía del queso. C. tyrobutyricum resultó ser un potente agente causal de la hinchazón tardía, si bien, otras especies de Clostridium también fueron capaces de producir hinchazón en queso, aunque en un grado mucho menor y en una etapa más avanzada de la maduración. C. tyrobutyricum presentó un comportamiento diferente durante la elaboración y maduración de los quesos modelo y los de tamaño real. En los primeros, germinó y esporuló en distintos momentos de la maduración. Sin embargo, en los quesos de tamaño real C. tyrobutyricum fue capaz de germinar tempranamente, durante la etapa de prensado, y su tasa de esporulación fue baja o inexistente durante la maduración. De los antimicrobianos estudiados in vitro, la nisina y la reuterina presentaron un amplio espectro anticlostridium en RCM y leche, inhibiendo el crecimiento de las células vegetativas y esporas de todas las cepas de Clostridium ensayadas. Sin embargo, la nisina producida in situ por Lactococcus lactis subesp. lactis INIA 415 no previno la hinchazón tardía del queso causada por C. tyrobutyricum, retrasando la aparición del defecto solo una semana. Por otro lado, la reuterina producida in situ por Lb. reuteri INIA P572 a partir de glicerol inhibió el crecimiento de C. tyrobutyricum y previno la aparición de hinchazón del queso, sin perjudicar su calidad sensorial cuando el glicerol se añadió a la leche en concentraciones inferiores a 100 mM. El estudio del efecto de las altas presiones sobre la germinación de esporas de C. tyrobutyricum fue limitado, ya que este microorganismo germinó antes de la presurización. Probablemente debido a ello, la aplicación de un solo ciclo de alta presión a 300 MPa fue suficiente para inactivar las células vegetativas de C. tyrobutyricum y evitar la hinchazón tardía del queso sin afectar a su calidad sensorial. La endolisina CTP1L, del bacteriófago virulento phi CTP1 de C. tyrobutyricum, presentó un espectro de actividad lítica prácticamente restringido a la cepa huésped, siendo incapaz de lisar cepas de Clostridium aisladas de quesos con hinchazón. Sin embargo, su espectro de unión fue amplio, con especificidad a nivel de género y, además, la endolisina fue capaz de unirse a esporas de Clostridium. La aplicación del domino de unión C terminal de la endolisina CTP1L marcado con GFP permitió, por primera vez, la visualización in situ de las células vegetativas de C. tyrobutyricum en queso, y estudiar su evolución y estado fisiológico mediante microscopía de contraste de fases y fluorescencia, revelando que las células vegetativas se lisan durante la maduración, y confirmando la baja tasa de esporulación de este microorganismo.