Factores clave implicados en la embriogénesis de microsporas inducida por estrés en cebada y colzametilación del DNA, proteínas de arabinogalactanos y auxina

Resumen

La embriogénesis de microsporas es un proceso in vitro en el que la microspora o polen inmaduro, mediante la aplicación de un tratamiento de estrés se reprograma y abandona su ruta de desarrollo gametofítico para iniciar la ruta embriogénica, dando lugar a embriones y plantas haploides y doble-haploides. Este proceso es de gran interés básico y aplicado en biotecnología y mejora vegetal para la obtención rápida de nuevas variedades, sin embargo aún tiene importantes limitaciones en su explotación por su baja eficiencia en muchas especies de interés económico. En esta tesis doctoral, se ha inducido la embriogénesis en cultivos de microsporas aisladas en dos especies, Hordeum vulgare (cebada) y Brassica napus (colza), mediante tratamientos de estrés a diferentes temperaturas, 4ºC y 32ºC respectivamente. Se han analizado tres factores: 1) la metilación del DNA, 2) las proteínas de arabinogalactanos (AGPs) y 3) la auxina endógena. Se ha estudiado la dinámica de estos factores durante el proceso de embriogénesis de microsporas, así como su función mediante el análisis del efecto de diversos inhibidores de estos factores sobre la inducción y eficiencia de embriogénesis. Se analizó la dinámica de metilación del DNA en el sistema de cebada. Los resultados mostraron que después del estrés y la inducción de embriogénesis de microsporas, los núcleos de las microsporas embriogénicas y los proembriones tempranos presentan niveles bajos de metilación y una señal débil de 5mdC, lo que indica que se produce una hipometilación global del DNA durante el cambio del programa de desarrollo y primeras divisiones embriogénicas, en cebada. Los tratamientos con 5-azacitidina (AzaC), inhibidor de la metilación del DNA, disminuyeron los niveles de metilación global y favorecieron el inicio de la embriogénesis de microsporas, en cebada y colza, mientras que en las etapas posteriores la AzaC afectó al desarrollo, dificultando la progresión de la embriogénesis de microsporas. El análisis de la distribución y dinámica de las proteínas de arabinogalactano (AGPs) durante la embriogénesis de microsporas en B. napus y H. vulgare mostró que las AGPs se inducen durante la embriogénesis de microsporas y que el bloqueo de AGPs con el reactivo de Yariv inhibe el proceso, en las dos especies. También, se analizaron los patrones de distribución de AGPs durante el desarrollo del polen en B. napus y los resultados han indicado que varias AGPs están relacionadas con la maduración y germinación de polen. Por el otro lado, el análisis del patrón de expresión del gen BnAGP Sta 39-4 en B. napus ha mostrado un aumento en la expresión este gen después del inicio de la embriogénesis de microsporas, lo que sugiere que las AGPs se inducen con el cambio de programa de desarrollo, constituyendo marcadores tempranos de la embriogénesis de microsporas. Por último, el estudio de la dinámica de auxina ha mostrado que esta hormona aumenta durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas, acumulándose en las células de los proembriones tempranos. El análisis del efecto del ácido 1-naftilftalámico (NPA), inhibidor del transporte polar de auxina, y del inhibidor de la acción de la auxina, ácido P-chlorophenoxyisobutytric (PCIB), sobre la embriogénesis de microsporas ha indicado que el transporte polar de auxina y su acción tienen un papel clave en la iniciación y progresión de la embriogénesis de microsporas en cebada, como también se había demostrado en colza, lo que sugiere un papel general de la auxina en el proceso. Los nuevos datos de esta tesis sugieren que la inducción de embriogénesis de microsporas requiere hipometilación del DNA, inducción de AGPs y de auxina, independientemente del estrés inductor y de la especie. Nuestros resultados podrían abrir nuevas vías para el diseño de nuevas estrategias biotecnológicas para la producción de doble-haploides más eficiente en programas de mejora de cultivos hortícolas y cereales.