Tolerancia al aluminio en centeno "(Secale cereale L)" mediada por el gen del transportador de malato ScALMT1

Resumo

El aluminio es el factor abiótico que más limita la producción de cereales en suelos ácidos. Entre los cereales, el centeno es el más tolerante al aluminio y, uno de los genes responsables de esta de tolerancia (Alt4) se ha localizado en el brazo cromosómico 7RS. Mediante un enfoque de genes candidato hemos logrado clonar y secuenciar un gen de la familia ALMT ("Aluminum-activated malate transporter") en centeno: ScALMT1. Dicho gen se ha localizado así mismo en el brazo cromosómico 7RS mediante amplificación en líneas de adición trigo-centeno. Valiéndose de los polimorfismos detectados en este gen entre los parentales (cultivar tolerante 'Ailés' y cultivar no tolerante 'Riodeva') de tres poblaciones F2 que segregaban para el locus Alt4, el gen ScALMT1 ha sido cartografiado y no se han detectado recombinantes entre el locus Alt4 y el gen. Además, se obtuvo un mapa del cromosoma 7R con el gen ScALMT1, el locus Alt4 y varios otros marcadores moleculares encontrándose ligamento absoluto entre ScALMT1 y Alt4, lo que sugiere la identidad de estos dos loci. Además se han obtenido secuencias ortólogas en otros cereales y especies vegetales, lo que indica la existencia de un mecanismo ancestral común de tolerancia al aluminio que se localiza en el grupo cuatro de homeología de cereales. La expresión de este gen fue evaluada usando diversas variables (estrés por aluminio, tejidos y cultivares de centeno). El enfoque seleccionado fue la PCR cuantitativa en tiempo real con la que se analizaba la cantidad de transcritos presentes. Los resultados mostraron que el gen tiene un comportamiento inducible después de la exposición a aluminio, que se expresa mayormente en el ápice de las raíces y su expresión es mucho mayor en los cultivares más tolerantes. Con el propósito de profundizar en los mecanismos involucrados en la regulación del gen ScALMT1, determinamos el número de copias presentes en diversos cultivares de centeno, mediante técnicas de hibridación y PCR cuantitativa. Así mismo, mediante la técnica de "Genome-Walker" hemos secuenciado las regiones flanqueantes del gen aguas arriba y aguas abajo. Uno de los resultados más significativos encontrados, es que al comparar el número de copias del gen en varios cultivares, la línea consanguínea menos tolerante al aluminio (Riodeva) demostró tener al menos el doble de copias del gen que la variedad más tolerante (Ailés). Este dato fue confirmado al secuenciar las regiones flanqueantes del gen, ya que encontramos más de un "alelo" en cada uno de los cultivares analizados. Estos resultados nos hacen pensar que el fenotipo de tolerancia al aluminio no se encuentra correlacionado con el número de copias del gen. Como cabía esperar, la región aguas arriba del gen parece haber sufrido menor tasa de cambios que la región aguas abajo, además de mostrar mayor nivel de conservación cuando se compara con la región homeóloga en otras especies. Esto nos hace suponer que dentro de esas regiones conservadas podrían encontrarse los elementos reguladores de la transcripción más significativos. Entre estos motivos reguladores podríamos suponer la causa de la diferencia en el patrón de expresión del gen entre centeno y trigo. Los resultados obtenidos del número de copoas del gen, así como sus secuencias flanqueantes y algunos fragmentos atípicos secuenciados, nos han llevado a pensar que un mecanismo de silenciamiento génico mediado por ARN podría estarse verificando. Una de las razones que nos llevó a pensar en un mecanismo de silenciamiento mediado por ARN fue la presencia de al menos tres dianas para micro ARN de plantas en la secuencia del ADNc del gen; sin embargo no pudimos demostrar la existencia en centeno, ni de estos micro ARN, ni la presencia de mensajeros truncados como resultado del procesamiento por el mecanismo enzimático Dicer. A pesar de ello, seguimos pensando que en este caso concreto sí existe un mecanismo de silenciamiento implicado, y que podría tener como base la metilación de la cromatina. La dilucidación de este mecanismo podría estar en la compleja estructura secundaria que procede de una secuencia palindrómica localizada en el intrón 4 del gen y que presenta todas las características necesarias para ser considerada un portador de un siARN. Estos hallazgos podrían ser el inicio del bosquejo de un modelo de autorregulación del gen ScALMT1 mediado por ARN.