Desarrollo y estandarización de técnicas de pcr múltiple para la detección de patógenos bacterianos de importancia en acuicultura

Résumé

El estudio se ha basado en el diseño de diferentes ensayos de PCR múltiple, como técnica de diagnóstico alternativa a los métodos microbiológicos tradicionales, para la detección simultánea de varios patógenos bacterianos de peces. En una primera parte, se ha desarrollado un ensayo de PCR múltiple para los principales patógenos bacterianos causantes de las estreptococosis de agua templada en peces (Lactococcus garvieae, Streptococcis iniae, Streptococcus parauberis y Streptococcus difficilis), enfermedades que causan cada vez mayores pérdidas económicas en la acuicultura española. En la puesta a punto de este ensayo de PCR se comprobó, en primer lugar, la especificidad de los oligonucleótidos seleccionados, descritos en la bibliografía, a partir de lo cual se procedió al diseño de nuevos indicadores para S. iniae, tomando como diana molecular el gen IctO de este patógeno, que codifica para la enzima lactato oxidasa. Los oligonucleótidos diseñados (denominados LOX-1 y LOX-2) amplifican de forma específica un fragmento de 870 pb del gen IctO de S. iniae. El límite de detección de esta PCR individual para la identificación de S. iniae, partiendo de ADN purificado, fue de 25 pg de ADN, y de 62-31 células por mezcla de reacción, partiendo de cultivos puros bacterianos. La PCR se ensayó también sobre tejidos de peces inoculados artificialmente, obteniéndose, en este caso, un límite de detección de 4 x 10elevado a 3 células/g de riñón y de 5 x 10elevado a 3 células/g de hígado o cerebro. Las cuatro parejas que finalmente se emplearon en la PCR múltiple desarrolla para la detección simultánea de los principales patógenos productores de estreptococosis, fueron: pLG-1/pLG-2 para L. garvieae, LOX-1/LOX-2, diseñados en este estudio, para S. iniae, Spa-2152/Spa-2870 para S. parauberis y Sdi-61/Sdi-252 para S. difficillis. La combinación de estas cuatro parejas de oligonucleótidos en un mismotubo de reacción dio lugar a la...