Efecto del procesado térmico, de presión y enzimático sobre alérgenos de frutos secos y su detección por PCR en tiempo real

Résumé

Los frutos secos son alimentos frecuentemente implicados en reacciones alérgicas. El procesado térmico y no térmico de los alimentos puede producir cambios estructurales en las proteínas alergénicas modulando su capacidad antigénica. En esta Tesis Doctoral se ha analizado el impacto del procesado térmico, de cocción (30 y 60 min) o con aplicación de presión (autoclave a 121¿C/1.18 atm o 138¿C/2.56 atm, 15 y 30 min), así como la combinación de éstos con hidrólisis enzimática con proteasas y sonicación, sobre la inmunoreactividad de los frutos secos pistacho y anacardo. Se han empleado técnicas de inmunodetección in vitro, LC-MS/MS, pruebas cutáneas en pacientes alérgicos y ensayos de liberación de mediadores de la respuesta alérgica. La cocción no reduce significativamente la capacidad de unir IgE de pistacho y anacardo con respecto al control, aunque disminuye la capacidad de inducir degranulación de basófilos. Al aplicar calor y presión, especialmente a 138¿C 30 minutos, la capacidad de anacardo y pistacho de unir IgE in vitro y en la superficie de células efectoras disminuye considerablemente. La digestión enzimática desencadena la proteólisis de alérgenos de anacardo y en especial de pistacho, reduciendo su reactividad frente a IgE. La combinación de tratamientos térmicos con hidrólisis enzimática representa una eficiente estrategia para reducir la inmunoreactividad de estos frutos. Se ha estudiado la influencia de los tratamientos de cocción y autoclave sobre compuestos fenólicos, actividad antioxidante y propiedades funcionales de pistacho, anacardo y castaña. El contenido de compuestos fenólicos se mantiene en los frutos secos procesados, incrementándose en castaña autoclavada a 138¿C 30 min. La actividad antioxidante tampoco resulta afectada en los tres frutos secos tratados. Se ha observado que tras la aplicación del procesado térmico y de presión, se mantienen algunas de las propiedades tecno-funcionales de las harinas de estos frutos, lo que permitiría su uso en la industria alimentaria. La normativa de seguridad alimentaria relacionada con riesgo alergénico exige identificar y etiquetar correctamente la presencia de frutos secos en alimentos. Por ello, es esencial desarrollar un método de detección sensible, específico, preciso y reproducible. Se han desarrollado protocolos, basados en la detección de ADN por PCR en tiempo real, que permiten la detección específica de nuez, pistacho y anacardo, usando como secuencias diana genes que codifican alérgenos. Se han empleado SYBR Green y sondas de hidrólisis LNA y TaqMan como químicas de reacción, desarrollándose métodos de detección de nuez con SYBR Green (Jug r 3; LOD de 100 ppm), de pistacho con sondas LNA (Pis v 1; LOD de 10 ppm) y de anacardo con ambos tipos de sondas, TaqMan y LNA (Ana o 1; LOD de 10 ppm). Se ha evaluado el efecto del procesado térmico y de presión sobre la detección de estos frutos secos. La cocción y las altas presiones hidrostáticas (HHP) no afectan a la detección. La aplicación de autoclave afecta a la integridad del ADN, dificultando la detección de las dianas. A pesar de ello, se ha conseguido detectar y cuantificar por PCR en tiempo real, la presencia de nuez, pistacho y anacardo en muestras procesadas. Estos métodos se han validado en alimentos comerciales obteniendo resultados más precisos que con ELISA.