Desarrollo de métodos de pcr en tiempo real para la detección y cuantificación de mohos productores de micotoxinas en alimentos

Resumen

En la superficie de los alimentos madurados (especialmente los productos cárnicos crudos-curados y quesos) y de aquellos que se someten a procesos de secado (especias, cereales y derivados) pueden desarrollarse una abundante población de mohos pertenecientes principalmente a los géneros Aspergillus y Penicillium. Algunas cepas de estas especies pueden producir micotoxinas, como aflatoxinas, ocratoxina A (OTA), patulina, ácido ciclopiazónico (ACP), esterigmatocistina y verrucosidina. Estos metabolitos fúngicos pueden tener efectos perjudiciales en la salud siendo compuestos extremadamente tóxicos con diferentes efectos carcinogénicos, teratogénicos y neurológicos. En el proceso de elaboración de este tipo de alimentos pueden utilizarse medidas preventivas que minimicen la presencia de mohos toxigénicos. Además es necesario disponer de métodos rápidos de detección y cuantificación de mohos, lo que permitiría detectar contaminaciones de estos mohos y adoptar medidas correctoras eliminando materias primas contaminadas, evitando de esta forma que los productos elaborados tengan micotoxinas. En este sentido, sería necesario disponer de métodos sensibles y rápidos para la detección y cuantificación de mohos productores de aflatoxinas, OTA, patulina, ACP, esterigmatocistina y verrucosidina en alimentos que puedan ser incorporados a los programas de vigilancia de sistemas de análisis de peligros y puntos de control crítico (APPCC). Los métodos convencionales para la detección de mohos productores de micotoxinas, son en general procedimientos lentos y laboriosos que requieren el aislamiento y cultivo de los mohos y la posterior confirmación de la producción de las micotoxinas. El conocimiento de genes relacionados con la síntesis de algunas micotoxinas ha permitido el diseño de procedimientos rápidos basados en la metodología de ácidos nucleicos para la detección sensible de mohos productores de la mayoría de las micotoxinas. Los métodos de PCR convencional o de sondas de hibridación sólo permiten la detección de alguno de los grupos de mohos productores de micotoxinas. Además, con la PCR convencional no es posible cuantificar la presencia de mohos productores de micotoxinas, aspecto este importante para conocer la relevancia de posibles fuentes de contaminación. La PCR en tiempo real (qPCR) ofrece una adecuada alternativa para cuantificar, además de ofrecer mayores prestaciones de sensibilidad y rapidez que la PCR convencional. Además permite la cuantificación simultánea de diferentes productos de PCR, lo cuál puede ser utilizado para la detección mediante PCR múltiple de los diferentes mohos productores de algunas de las micotoxinas indicadas en alimentos. En la actualidad, los métodos de qPCR existentes en la bibliografía detectan y cuantifican determinadas especies de mohos toxigénicas. Sin embargo desde el punto de vista de la seguridad alimentaria sería necesario disponer de métodos de qPCR que permitan detectar y cuantificar mohos toxigénicos independientemente del género o especie al que pertenezca, y además. Los objetivos de este trabajo son los de desarrollar protocolos de qPCR (simples y múltiples) que permitan detectar y cuantificar mohos productores de aflatoxinas, OTA, patulina, ACP, esterigmatocistina y verrucosidina en alimentos. Se pretende además evaluar la sensibilidad, especificidad y eficiencia de los métodos desarrollados en la cuantificación de mohos productores de micotoxinas en los alimentos. En el desarrollo de este trabajo se han utilizado 79 cepas de referencia pertenecientes a diferentes Colecciones de Cultivo. Se ha evaluado la producción de micotoxinas de estas cepas en medios de cultivo utilizando las técnicas de TLC, ECEM y HPLC-MS. Se confirmó la producción de aflatoxinas, OTA, patulina, ACP, esterigmatocistina y verrucosidina en la mayoría de las cepas de mohos identificadas como productoras por sus respectivas Colecciones de Cultivo, así como en algunas cepas de las que no se disponía de información sobre producción de micotoxinas. Además, aquellas especies productoras de micotoxinas (cepas aflatoxigénicas y ocratoxigénicas) que no habían sido descritas con anterioridad en la bibliografía como tales, fueron identificadas mediante secuenciaciones parciales del gen de la ß-tubulina y de la región ribosomal ITS1-5,8S-ITS2 para su posterior comparación con secuencias ya publicadas en la base de datos. Todas las cepas que produjeron alguna de las micotoxinas estudiadas se consideraron productoras para los posteriores ensayos de qPCR. Previamente al desarrollo de los métodos de qPCR, se optimizó un protocolo de extracción de ADN a partir de alimentos capaz de obtener ADN fúngico adecuado para su utilización en la cuantificación mediante qPCR de mohos toxigénicos en alimentos. Para tal fin se evaluaron 6 protocolos de extracción que combinaron distintos métodos de ruptura de esporas, tampones de extracción, kits de extracción comerciales y disolventes de extracción de ADN. Se seleccionaron los métodos ¿Chelex100-enzimático-EZNA¿ y ¿CTAB-EZNA¿ por obtenerse con ellos la mayor cantidad y calidad del ADN fúngico a partir de alimentos. El primero de estos métodos combina un tratamiento enzimático con proteinasa K y liticasa, con la resina Chelex100 y con la utilización del kit EZNA. El método ¿CTAB-EZNA¿ combina la ruptura térmica de los mohos con la extracción con el tampón de CTAB, proteinasa K y el kit ¿EZNA¿. Ambos métodos pueden utilizarse de forma indistinta en los protocolos desarrollados de qPCR. Los cebadores y sondas de los métodos de qPCR desarrollados para cuantificar mohos productores de aflatoxinas, OTA y patulina fueron diseñados a partir de secuencias obtenidas de productos de PCR amplificados mediante cebadores de la bibliografía basados en los genes omt-1, otanpsPN e idh implicados en la biosíntesis de aflatoxinas, OTA y patulina respectivamente. En el caso de los métodos de qPCR desarrollados para cuantificar mohos productores de ACP, esterigmatocistina y verrucosidina, los cebadores y sondas se diseñaron a partir de secuencias conocidas de los genes dmaT y fluG y de la sonda SVr1 respectivamente, todas ellas relacionadas con la síntesis de dichas micotoxinas. Además, se diseñaron controles internos de amplificación (IAC) para su inclusión en los métodos de qPCR y evitar falsos resultados negativos. Así se diseñó un IAC no competitivo basado en el gen de la ß-tubulina y un IAC competitivo diseñado a partir del gen hly de L. monocytogenes, para la validación de los ensayos de qPCR que cuantifican los mohos productores de verrucosidina y ACP, respectivamente. Por último, el diseño de un protocolo de qPCR múltiple basado en los genes omt-1, otanpsPN y idh permitió cuantificar simultáneamente mohos productores de aflatoxinas, OTA y patulina. Los métodos de qPCR (basados en SYBR Green o en TaqMan) desarrollados en esta Tesis Doctoral son muy específicos dado que discriminan entre cepas productoras y no productoras de cada una de las micotoxinas, no existiendo amplificación cruzada en ningún caso. Además, la sensibilidad de todos los métodos de qPCR desarrollados es muy elevada alcanzándose límites de detección de hasta 0,01 pg de ADN genómico de las cepas productoras. La eficiencia de amplificación de todos los métodos desarrollados, evaluada mediante concentraciones de ADN o número de copias del gen amplificado, es adecuada debido a que sus valores se encuentran dentro del rango óptimo (entre 80-110 %) propuesto para considerar que una reacción de qPCR ha sido optimizada adecuadamente y que no ha habido errores en dicho proceso. Los métodos de qPCR desarrollados fueron validados en alimentos. Estos mostraron valores de sensibilidad muy elevados, como prueba el hecho de que los límites de detección estuvieran en la mayoría de los casos entre 1 y 2 log esporas de mohos productores por gramo. No hubo en ningún caso amplificación cuando se inocularon esporas de mohos no toxigénicos, lo que demuestra la robustez de los métodos desarrollados. Las eficiencias de amplificación en alimentos estuvieron en la mayoría de los casos dentro del rango óptimo establecido (entre 80-110 %) o muy cercano a él. Se elaboró un protocolo para evaluar la reproducibilidad y repetibilidad de los métodos de qPCR. Se ensayó este protocolo en los métodos de qPCR desarrollados para la cuantificación de mohos productores de aflatoxinas, que mostraron altos valores de reproducibilidad y repetibilidad. Además los métodos de qPCR desarrollados cuantifican de forma sensible el desarrollo del micelio de mohos productores en alimentos. Finalmente se ensayó la eficacia de los métodos desarrollados en la cuantificación de mohos productores en muestras de alimentos procedentes de la industria alimentaria. Se evaluaron productos durante el procesado (jamón curado al inicio de secado-maduración) y alimentos acabados (pimentón, semolina de trigo y jamón curado). En los productos en proceso se estudió la capacidad de los métodos de qPCR desarrollados de detectar los mohos productores antes de la producción de las correspondientes micotoxinas. En todos los casos los métodos de qPCR probados mostraron buena capacidad para detectar contaminación natural por mohos toxigénicos en muestras de alimentos procedentes de la industria alimentaria. Los métodos probados detectaron la contaminación por mohos toxigénicos antes de la producción de la toxina. Si bien sería conveniente realizar más ensayos de alimentos y probar todos los métodos desarrollados, los resultados preliminares de aplicación en muestras alimentarias obtenidos, parecen indicar que son protocolos de gran utilidad para la monitorización y/o verificación de mohos productores de micotoxinas en los sistemas APPCC de la industria alimentaria. Por todo ello se proponen estos protocolos para la cuantificación sensible de mohos toxigénicos en alimentos, especialmente en materias primas y productos en proceso, para tratar de evitar la producción de alimentos contaminados con micotoxinas.