Respuesta a estrés por sales biliares en bifidobacterias. Estudios fisiológicos y moleculares
- Ruiz García, Lorena
- Abelardo Margolles Doktorvater/Doktormutter
- Luis Manuel Quirós Fernández Doktorvater/Doktormutter
- Clara González de los Reyes Gavilán Doktorvater/Doktormutter
Universität der Verteidigung: Universidad de Oviedo
Fecha de defensa: 13 von April von 2011
- Juan Evaristo Suárez Präsident/in
- Patricia Rúas Madiedo Sekretär/in
- Manuel Zuñiga Cabrera Vocal
- C. Herranz Sorribes Vocal
- Douwe van Sinderen Vocal
Art: Dissertation
Zusammenfassung
Entre las propiedades que confieren a los microorganismos probióticos una ventaja selectiva para la colonización del tracto gastrointestinal (TGI), la resistencia a la acción tóxica de ácidos y sales biliares es de particular interés. La presencia de estos compuestos en el ambiente intestinal representa un reto tanto para la supervivencia como para la funcionalidad de los microorganismos que, siendo componentes de la microbiota comensal o habiendo sido administrados oralmente como probióticos, alcanzan esta localización. La microbiota intestinal ha debido desarrollar estrategias para sobrevivir en presencia de estos compuestos, sin embargo, aún se sabe muy poco sobre los mecanismos de resistencia a sales biliares en bifidobacterias. Con el objetivo principal de profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la respuesta a estrés por bilis en miembros del género Bifidobacterium, y con el fin de aprovechar al máximo la información contenida en los genomas de estos microorganismos, a lo largo del presente trabajo se han empleado aproximaciones proteómicas y transcriptómicas. Los resultados obtenidos en este trabajo revelaron que en respuesta a la presencia de sales biliares se producen importantes reorganizaciones metabólicas que afectan a la expresión de genes pertenecientes a grupos funcionales diversos. Uno de los resultados más notables que se desprende de este trabajo es que la presencia de sales biliares modifica la expresión de enzimas implicados en la producción de componentes de la superficie celular así como de proteínas de membrana. Debido a que en la membrana celular se encuentran los sistemas de recepción y transducción de señales, así como las estructuras responsables de la interacción con las células del hospedador, estos cambios podrían tener efectos significativos sobre la funcionalidad y viabilidad de los microorganismos probióticos. El análisis de células de B. animalis expuestas a sales biliares demostró cambios morfológicos, en la composición de ácidos grasos, en la relación fosfolípido-proteína en membranas y en la movilidad lateral de sondas fluorescentes incorporadas en la bicapa lipídica, apoyando el efecto de la bilis sobre la modificación de las propiedades superficiales de las bifidobacterias. Las proteínas asociadas a la superficie bacteriana son con frecuencia las macromoléculas implicadas en la interacción con las células del hospedador, pudiendo por tanto condicionar el tiempo de residencia de la microbiota intestinal, así como su funcionalidad. Por este motivo, uno de los trabajos llevados a cabo en la presente Tesis Doctoral consistió en la determinación del proteoma de superficie en una cepa de B. longum, y su modulación por bilis. Uno de los resultados más notables derivados de este trabajo fue la identificación en las envueltas celulares de clásicas proteínas citosólicas, tales como enolasa, DnaK o factor de elongación Tu, carentes de motivos secretores conocidos, algunas de las cuales aparecían además sobre-representadas en presencia de sales biliares. Estas proteínas habían sido identificadas previamente en trabajos desarrollados por grupos independientes, en la superficie de otros microorganismos, en los que se les atribuyó un papel en la colonización del ambiente intestinal debido a su capacidad de unir plasminógeno humano. Por otra parte, el análisis transcripcional de la respuesta a sales biliares en una cepa de B. breve UCC2003, reveló la sobre-expresión de un elevado porcentaje de los transportadores anotados en el genoma de este microorganismo. Hasta el momento, varios transportadores han sido descritos por su implicación en la resistencia a sales biliares en bacterias. El aumento de la resistencia está mediado por una función de eliminación de sales biliares o transporte de otros compuestos que contribuyan al mantenimiento de la homeostasis. En el trabajo que se presenta en esta Tesis Doctoral, la expresión heteróloga de una selección de transportadores de B. breve inducibles por bilis, así como una proteína de la familia Dps (DNA protection under starvation) en L. lactis, demostró su participación en la tolerancia a bilis. Finalmente, el gen Bbr_0838, que demostró los mayores niveles de inducción por sales biliares bajo nuestras condiciones de estudio, y que presenta una elevada homología con un sistema de eliminación de sales biliares de B. longum (BL0920), fue caracterizado en detalle mediante la construcción de un mutante insercional. El análisis fenotípico de la cepa mutante, así como de una complementada con el gen nativo, demostró que desempeña un papel relevante en la tolerancia a bilis en B. breve. Por otra parte, el análisis preliminar de la región promotora de dicho gen, mediante primer extension y construcción de fusiones transcripcionales de diferentes fragmentos a genes reporter, permitió determinar el inicio de transcripción, la región necesaria para la inducción por bilis así como posibles regiones reguladoras. La estrecha regulación de este promotor por sales biliares, nos lleva a postular su posible aplicación biotecnológica para el desarrollo de sistemas de expresión en bifidobacterias inducibles por factores específicos del TGI.