Caracterización del mutante nfxB de Pseudomonas aeruginosapapel en la resistencia antibiótica de los biofilms e interacción con los mecanismos de resistencia intrínsecos.

Resumen

La azitromicina ha mostrado resultados prometedores en el tratamiento de la infección respiratoria crónica por P. aeruginosa. No presenta actividad bactericida frente a este microorganismo en cultivo planctónico, pero se sabe que este macrólido inhibe la formación de biofilms gracias a su capacidad para interferir en el sistema quorum sensing bacteriano. En las infecciones crónicas frecuentemente se seleccionan mutantes que presentan un alto grado de adaptación al nicho ecológico y a los antimicrobianos, como ocurre con el mutante en nfxB, gen regulador negativo de la bomba de expulsión activa MexCD-OprJ. Este fenotipo es frecuentemente aislado en pacientes con fibrosis quística, EPOC y bronquiectasias, y se caracteriza por presentar resistencia a los antimicrobianos que puedan actuar como sustrato y por presentar una marcada hipersensibilidad a antibióticos betalactámicos no sustratos de la bomba y aminoglucósidos. Uno de los objetivos del presente trabajo fue averiguar si durante la exposición prolongada a azitromicina se seleccionan mutantes nfxB tanto en crecimiento planctónico como en forma de biofilm. Se evaluó el impacto de la hiperproducción de alginato y el efecto de la hipermutación sobre el efecto bactericida, sobre la dinámica de desarrollo de resistencias a azitromicina y sobre la posible aparición de resistencias cruzadas. También fue objeto de estudio la caracterización del mutante nfxB, así como la relación entre la hiperexpresión de MexCD-OprJ, la actividad de la cefalosporinasa cromosómica AmpC, y las bombas de expulsión intrínsecas MexAB-OprM y MexXY-OprM. Para llevar a cabo tales objetivos se construyeron mutantes deficientes en el gen mucA, mutS y la combinación de ambos y se evaluó su comportamiento en forma de biofilm al ser tratado con diversas concentraciones de azitromicina durante varios días. Se caracterizaron los mutantes resistentes a azitromicina, se determinó su perfil de sensibilidad, se cuantificó la expresión relativa de mexD mediante PCR a tiempo real y finalmente se secuenció su gen regulador nfxB revelando diversas mutaciones inactivantes. En síntesis, los resultados obtenidos demuestran que durante el tratamiento de los biofilms con azitromicina existe una selección de mutantes nfxB en las cepas salvajes, hiperproductoras de alginato y particularmente en las cepas hipermutadoras. Seguidamente se construyó el mutante nulo nfxB y se evaluaron sus propiedades biológicas, su sensibilidad al complemento del suero humano, la tasa y frecuencia de mutación en rifampicina. Finalmente se analizó su transcriptoma, mostrando que aparentemente no se sobrexpresan genes implicados en la resistencia antimicrobiana, a excepción de los pertenecientes al sistema mexCD-oprJ. Aunque en el perfil de proteínas fijadoras de penicilina no se hallaron diferencias entre el mutante nfxB y la cepa de referencia, el análisis de proteínas de membrana externa reveló una disminución de la expresión de de OprM, responsable de la hipersensibilidad a aminoglucósidos y betalactámicos con la excepción del imipenem. De igual forma, la disminución de la expresión de OprM no justificó la reversión del fenotipo de resistencia a betalactámicos en el mutante nfxB-dacB. Sin embargo, la determinación fraccionada (extracto crudo, periplasma y sobrenadante) de la actividad betalactamasa específica del mutante nfxB y del mutante doble nfxB-dacB reveló un drástico descenso de la actividad periplasmática, a expensas de un aumento de la actividad determinada en el sobrenadante. Nuestros datos revelan que la hipersensibilidad a betalactámicos es debida a la incapacidad para mantener AmpC en el espacio periplásmico, produciéndose una permeabilización al medio extracelular. No obstante un análisis más profundo de este fenómeno nos ha permitido demostrar cómo dicha permeabilización resulta beneficiosa en el seno de un biofilm tratado con betalactámicos, ya que AmpC quedaría recluido en su matriz. Finalmente, los datos preliminares sugieren que la permeabilización que experimenta AmpC en el mutante nfxB ocurre también para otras betalactamasas, particularmente de las clases B y D.