Ecología y funcionalidad de la microbiota biliar humana. Relación con la dieta y patología biliar

Resumen

La microbiota del sistema gastrointestinal humano y su relación con diferentes estados fisiológicos ha sido objeto de numerosos estudios durante las últimas décadas. Sin embargo, la microbiota de la bilis y de la vesícula biliar apenas ha sido estudiada, debido fundamentalmente a la falta de protocolos adecuados y a la dificultad de tomar muestras de este ambiente. En la actualidad existen algunos trabajos que se han enfocado en analizar la microbiota biliar de animales o de pacientes con alguna patología biliar, sin embargo, hasta el inicio de esta Tesis Doctoral, no se ha realizado ningún estudio del microbioma biliar mediante el empleo de técnicas multi-ómicas en pacientes sin patología hepatobiliar. Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido caracterizar y estudiar en detalle el microbioma de la bilis humana, así como analizar su posible relación con la dieta y con la presencia de cálculos biliares o colelitiasis (la patología biliar más frecuente). Para ello, se optimizo un protocolo de extracción de ADN de bilis, y posteriormente, a través de metagenómica filogenética, se analizaron los perfiles microbianos biliares de un grupo de 13 sujetos donantes de hígado sin patologías hepatobiliares, considerado grupo control, y de un grupo de 14 pacientes con colelitiasis. Los resultados mostraron por primera vez la presencia de un ecosistema microbiano biliar, fundamentalmente compuesto por miembros de los filos Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria y Proteobacteria. La comparación de los perfiles microbianos característicos de ambos grupos mostró diferencias significativas en la abundancia relativa de algunos taxones, destacando miembros de los géneros Bacteroides y Escherichia-Shigella, que presentaron mayor abundancia relativa en la bilis de los pacientes con colelitiasis. El análisis mediante metagenómica funcional de la microbiota biliar y su comparación con el perfil funcional de la microbiota intestinal reveló diferencias significativas en la abundancia relativa de actividades relacionadas con el metabolismo del colesterol y sales biliares, presentando estas actividades una mayor frecuencia en el microbioma biliar. Finalmente, el análisis metabonómico por resonancia magnética nuclear de la bilis del grupo control y el grupo con colelitiasis mostró perfiles metabólicos distintos. Por otro lado, la comparación de la ingesta de distintos componentes de la dieta y de los niveles de los principales parámetros sanguíneos entre el grupo de pacientes con colelitiasis y un grupo de 13 individuos sanos mostró diferencias significativas, destacando un menor consumo de vegetales y mayores niveles de triglicéridos en sangre en los pacientes con colelitiasis. El análisis de la posible relación entre los componentes de la dieta y la microbiota biliar en el grupo con colelitiasis reveló la presencia de asociaciones estadísticas entre ciertos micro- y macronutrientes y algunos taxones, destacando una asociación negativa entre el consumo de fibra insoluble y la abundancia relativa de miembros del género Bacteroides. El cultivo de muestras de bilis humana permitió aislar dos cepas del orden Clostridiales: IPLA60001, perteneciente a la especie Ruminococcus gauvreauii; e IPLA60002, que mostró una baja identidad con las secuencias del gen ARNr16S disponibles en las bases de datos, siendo la especie más cercana Ruminococcus bromii. IPLA60002 mostró características particulares, entre las que destaca una mayor resistencia a sales biliares y un fenotipo de autolisis. Los resultados del análisis genómico y filogenético permitieron proponer esta cepa como perteneciente a una nueva especie, denominada Ruminocoides biliarensis. Finalmente, el análisis bioquímico, genómico y transcriptómico de las cepas IPLA60001 e IPLA60002 en mono y co-cultivo, llevado a cabo con el fin de estudiar la posible relación metabólica entre las mismas, mostró una relación de alimentación cruzada a nivel del formato y otros nutrientes, revelando una posible cooperación o relación de simbiosis que les podría permitir subsistir en el complejo ecosistema biliar.