Digestibility of milk and egg white allergens. Immunological responses, peptides released and mapping of epitopes / digestibilidad de alérgenos de leche y clara de huevo. Respuesta inmunológica y caracterización de péptidos y epítopos

Resumen

La alergia a leche y huevo presenta una alta incidencia en continuo aumento en Europa y Estados Unidos, sobre todo en la población infantil. Los principales alérgenos de estos productos son glicoproteínas, y para inducir una respuesta alérgica, deben ser capaces de atravesar la barrera intestinal manteniendo la suficiente integridad estructural como para interactuar con el sistema inmune. Por ello, una de las características principales de los alérgenos alimentarios es su resistencia a la digestión gastrointestinal y es importante evaluar si los fragmentos generados durante este proceso retienen epítopos de unión a IgE. Dados los múltiples factores que intervienen en la digestión fisiológica, la validez de la estabilidad frente a la digestión in vitro como criterio para estimar el potencial alergénico de las proteínas está siendo muy discutida. En esta tesis doctoral, se han llevado a cabo digestiones con fluidos orales, gástricos y duodenales humanos y simulados con enzimas comerciales de tres proteínas alimentarias alergénicas, ß-caseína ß-CN, ß-Lactoglobulina (ß-LG), y Ovoalbumina (OVA). Los resultados mostraron similares patrones de hidrólisis e inmunorreactividad de los digeridos con los dos modelos de digestión, aunque la degradación proteica fue más rápida con fluidos humanos que con simulados. Los análisis por microarray y dot blot mostraron que algunos de los péptidos resultantes de la digestión mantienen su capacidad alergénica. Las áreas inmunorreactivas más destacadas fueron ß-CN (57-68) y ß-CN (82-93) en el caso de la ß-CN; ß-LG (43-60), ß-LG (47-62), ß-LG (86-99), ß-LG (86-100) y ß-LG (135-147) para ß-LG, y OVA (370-385) en el caso de OVA. Por otro lado también se estudió el efecto de los residuos de carbohidratos unidos al ovomucoide (OM), alérgeno inmunodominante del huevo, en su alergenicidad y digestibilidad. Se comprobó que tras la desglicosilación enzimática del OM, la proteína mantenía su estructura inalterada y el 80% de los pacientes estudiados mostraron una menor capacidad de unión a IgE comparado con el OM glicosilado. Además, se demostró la presencia de epítopos reactivos frente a IgE específicos para la proteína glicosilada. El OM desglicosilado fue más susceptible a la proteolisis durante la digestión pero el patrón peptídico resultante fue muy parecido. La inmunorreactividad de los digeridos disminuyó hasta valores de entre el 1 y el 4% al final de la digestión, pero algunos de los péptidos identificados demostraron mantener su capacidad de unión a IgE, entre los que destacan el péptido OM (80-89) y las regiones OM (36-61), OM (100-122) y OM (133-180) que reaccionaron en el 40-100% de los pacientes ensayados. Por último, se identificaron los péptidos generados durante la digestión gastrointestinal in vitro de uno de los mayores alérgenos del huevo, la lisozima (LYS). Los resultados indicaron que los digeridos gástrico y duodenal mantenían su capacidad de unión a IgE y de activar basófilos. Esta actividad biológica podría ser atribuida a la presencia de LYS intacta, al fragmento (24-129) producido por la acción de la quimiotripsina o a la liberación de péptidos inmunorreactivos unidos por puentes disulfuro que contenían los epítopos LYS (11-27), LYS (57-83) y LYS (108-122). El hecho de que importantes epítopos lineales puedan ser liberados durante la digestión de la LYS llevó a estudiar el caso de un niño alérgico al huevo, que tolerando huevo después de un tratamiento de inmunoterapia, sufrió una fuerte reacción alérgica a un medicamento que contenía LYS y papaína, por lo que se planteó la hipótesis de que la presencia de papaína, podría incrementar el potencial alergénico de la LYS. Los resultados indicaron que la LYS tratada con papaína dio lugar a fragmentos con una alta capacidad de unión a IgE que fueron identificados como LYS (22-129), LYS (34-96) y LYS (62-128). Además estos fragmentos podrían permanecer unidos por puentes disulfuro formando grandes estructuras que podrían tener una capacidad de unión a IgE aumentada.