Procesos catalizados por lipasasoptimización de la estabilidad y enantioselectividad de una lipasa termorresistente

Résumé

La BTL2 (lipasa 2 de Geobacillus thermocatenulatus, anteriormente Bacillus) se utilizó como enzima modelo para incrementar su potencial como biocatalizador industrial mediante el diseño de diferentes estrategias para mejorar la estabilidad térmica y en codisolventes, capacidad de reactivación, actividad catalítica y selectividad. BTL2 se purificó con bastante facilidad, principalmente por adsorción selectiva sobre octil-agarosa y desorción posterior con detergente. Finalmente se realizó un intercambio aniónico sobre Sepharose-Q. La enzima pura, en presencia de Triton X-100 se cristalizó y se determinó su estructura tridimensional que correspondió a la forma abierta (sitio activo expuesto al solvente). Por modelaje matemático se pudo proponer el mecanismo de activación y apertura de BTL2. Para los estudios de estabilidad, se prepararon derivados de BTL2 obtenidos por unión covalente unipuntual suave (sobre bromuro de cianógeno- agarosa), y derivados inmovilizados por unión covalente multipuntual sobre glioxil-agarosa. Para mejorar la estabilidad de los derivados se realizó aminación no dirigida en fase sólida de la BTL2 convirtiendo las cadenas laterales tipo carboxilo (de Asp + Glu) en grupos amino. La posterior inmovilización multipuntual sobre glioxil-agarosa originó nuevos derivados mucho más estables; la presencia de DTT permitió disminuir el pH de inmovilización. También se desarrolló una estrategia de inmovilización multipuntual dirigida de mutantes de BTL2 enriquecida en grupos amino por vía química o genética. Los mutantes con una cisteína introducida en diferentes regiones superficiales de la enzima fueron más estables que los derivados obtenidos por rigidificación no dirigida de la enzima nativa. Algunos mutantes se enriquecieron en 4 y 6 residuos lisil mediante mutagénesis dirigida, logrando mayores factores de estabilización pero con actividades específicas e intrínsecas inferiores a los derivados mutantes sin enriquecer en residuos lisil. La aminación química en fase sólida resultó ser más conveniente que la aminación genética en términos de productividad de los catalizadores Se aplicaron metodologías sencillas para la reactivación de derivados covalentes de BTL2, inactivados por efecto de agentes desnaturalizantes concentrados como la guanidina o dioxano. La presencia de aditivos adecuados permitió reactivar de modo completo y rápido a los derivados de BTL2. La presencia de aditivos en concentraciones moderadas como detergentes, de dioxano o de una combinación de ambos, permitió incrementar sinérgicamente la actividad en la hidrólisis de p-NPB de los derivados modificados unipuntualmente con polímeros. Estas mejoras de actividad hidrolítica estarían relacionadas con la estabilización de la forma abierta de BTL2. Tanto el grado de rigidificación como la orientación de la enzima en el soporte, influyeron en la selectividad y actividad de los derivados generados, muy probablemente porque se está modificando la forma exacta del centro activo y las zonas de adsorción de los sustratos.