Evaluación de las propiedades biológicas de antioxidantes fenólicos en subproducto de uva, café verde y yerba mate como ingredientes funcionales o nutracéuticos

Resumen

Estudios epidemiológicos han mostrado repetidamente un asociación inversa entre el riesgo de enfermedades crónicas y el consumo de una dieta rica en compuestos fenólicos. La uva es uno de los cultivos de mayor producción hortofrutícola en el mundo, siendo un alimento muy rico en polifenoles. Su empleo en la elaboración de vino produce una gran cantidad de subproductos de uva, con un alto contenido en polifenoles, principalmente antocianos (en uva tinta), catequinas, glicósidos de flavonoles, ácidos y alcoholes fenólicos y estilbenos. Por tanto, los subproductos de uva son una importante fuente de antioxidantes fenólicos, siendo importante evaluar sus propiedades biológicas para profundizar en el conocimiento del potencial de este producto como ingrediente funcional o nutracéutico. La yerba mate y el café destacan entre las bebidas más populares mundialmente. El café verde y el mate tienen una composición fenólica similar. El café verde contiene ácidos clorogénicos, cinamoil amidas y glicósidos y ácidos fenólicos libres, mientras que la yerba mate además de estos ácidos hidroxicinámicos contiene flavonoles como la rutina y otros glicósidos de flavonoles. Además de su creciente consumo como ingredientes en nutracéuticos, el mate es ampliamente consumido como infusión, mientras que la ingesta de café verde como infusión o en mezcla con café tostado está incrementando en los últimos años como una alternativa más saludable al café tostado. Las propiedades biológicas de los flavonoides han sido extensivamente estudiadas; asimismo, en los últimos años ha ganado interés y presencia en la literatura científica los estudios sobre ácidos clorogénicos. Sin embargo, otros ácidos fenólicos han sido menos estudiados in vitro e in vivo, e igualmente, los estudios sobre la actividad biológica de metabolitos circulantes son todavía muy escasos. Por otro lado, el empleo de líneas celulares inmortalizadas como modelo para el estudio de los efectos quimioprotectores de fitoquímicos, entre otras actividades biológicas, es ampliamente aceptado La hipótesis de esta tesis fue que los subproductos de uva, el café verde y la yerba mate, como productos ricos en compuestos fenólicos, pueden presentar propiedades biológicas que podrían resultar en efectos beneficiosos para la salud, particularmente en enfermedades asociadas con el estrés Resumen 10 oxidativo y, por tanto, pueden presentar relevancia como ingredientes funcionales o nutracéuticos. Objetivos y Resultados El principal objetivo de esta tesis doctoral fue investigar ciertas propiedades biológicas de los antioxidantes fenólicos de un subproducto de uva, yerba mate y café verde. En primer lugar, se caracterizó la composición fenólica del subproducto de uva mediante análisis por HPLC-DAD y HPLC-ESI-QToF. Además, el contenido fenólico total del extracto fenólico del subproducto de uva tinta se determinó por el método de Folin-Ciocalteau. Los análisis cromatográficos mostraron que el contenido fenólico total fue de 2211.6 μg/g de muestra seca, siendo los componentes mayoritarios los ácidos fenólicos (1877.1 μg/g), con un menor contenido de flavonoles (305.5 μg/g) y antocianos (29.0 μg/g). Los ácidos gálico, elágico y protocatéquico fueron los fenoles más abundantes en el extracto del subproducto de uva. Además, este subproducto mostró una alta capacidad antioxidante de acuerdo a los datos obtenidos por los métodos ABTS, ORAC y FRAP. Adicionalmente, se estudió el efecto del almacenamiento y de la digestión gastrointestinal in vitro sobre el contenido fenólico y la capacidad antioxidante del subproducto de uva tinta. Tras 3 y 6 meses de almacenamiento a 4 o 25ºC no se observaron cambios en la concentración total de polifenoles ni en el contenido en taninos condensados, no afectándose la capacidad antioxidante (evaluada por los métodos ABTS, FRAP y ORAC); sin embargo, tras 9 meses estos parámetros descendieron. El tiempo y la temperatura de almacenamiento afectaron el color de las muestras, con un color rojo más intenso al final del estudio. Las muestras fueron microbiológicamente seguras y libres de bacterias patógenas durante todo el experimento. Respecto a la estabilidad del subproducto de uva tras la digestión gastrointestinal in vitro, la etapa gástrica no produjo cambios en la composición fenólica, si bien tras la digestión intestinal el contenido polifenólico (los ácidos fenólicos, flavonoles y antocianos disminuyeron un 9, 34 y 100%, respectivamente) y la capacidad antioxidante disminuyeron. Resumen 11 También se estudiaron las propiedades antioxidantes y antiproliferativas del subproducto de uva tinta y sus principales ácidos hidroxibenzóicos (ácidos gálico y siríngico) en células Caco-2. Inicialmente, el tratamiento directo con el extracto del subproducto de uva tinta, ácido gálico o ácido siríngico durante 20 h no alteró la viabilidad celular, las defensas antioxidantes (contenido en GSH, actividad de GPx y GR) o la oxidación proteica. Sin embargo, cuando se indujo un estrés oxidativo por tratamiento con tert-butilhidroperóxido en las células Caco-2, los ácidos hidroxibenzóicos y el extracto del subproducto de vinificación mostraron efectos quimioprotectores, reduciendo la sobreproducción de ROS, mejorando la viabilidad, previniendo la depleción de GSH y la oxidación de proteínas, e incrementando la actividad de las enzimas GPx y GR. En otros experimentos, el efecto protector de extractos de café verde y yerba mate, de su principal compuesto fenólico (5-CQA) y de los metabolitos de origen microbiano (DHCA y DHFA) frente a inflamación inducida por TNF-α se evaluó en células endoteliales EA.hy926. La citotoxicidad inducida por TNF-α fue parcialmente prevenida cuando las células fueron pretratadas con los extractos de café verde y mate, así como con 5-CQA y DHCA. Además, se observó la reducción en la producción de ROS, evitando la depleción de GSH y aumentando la actividad de GR y GPx; asimismo, la oxidación proteica disminuyó y se produjo un aumento en la concentración de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS). Finalmente, el efecto antiproliferativo de extractos de café verde y yerba mate, sus principales constituyentes fenólicos (5-CQA and 3,5-DCQA) y metabolitos (ácidos ferúlico, cafeico, DHFA y DHCA) se estudió en líneas celulares humanas de cáncer de colon (Caco-2), pulmón (A549), esófago (OE-33) y vejiga urinaria (T24), además de en una línea colónica no cancerosa (CCD-18Co). Las células se trataron con distintas concentraciones de extractos y patrones durante 2 y 24 h para simular condiciones de exposición aguda y crónica, respectivamente. El extracto de yerba mate redujo significativamente la viabilidad celular en todas las líneas celulares cancerígenas en todas las concentraciones estudiadas, las dosis más altas disminuyendo también la proliferación celular. Los efectos del extracto de café verde reduciendo la viabilidad celular fueron también notables, si bien su capacidad para reducir la proliferación celular fue más modesta, salvo en las líneas Caco-2 y T24. Los ácidos 5-CQA y 3,5- DCQA redujeron la viabilidad y proliferación celular en todas Resumen 12 las líneas cancerígenas en las dosis mayores, mientras que el ácido ferúlico, DHCA y DHFA presentaron efectos menores y variables dependiendo de la línea celular y la dosis empleada. Por el contrario, la cafeína no tuvo efecto en ninguna de las líneas celulares estudiadas. Conclusiones El subproducto de uva tinta es rico en ácidos hidroxibenóicos, flavonoles y ácidos hidroxicinámicos, teniendo una elevada capacidad antioxidante y siendo bastante estable durante su almacenamiento en frío (4°C) o a temperatura ambiente. Durante la digestión gastrointestinal in vitro, los polifenoles son más sensibles en las condiciones ligeramente alcalinas del intestino delgado, reduciéndose su contenido. Además, el extracto de subproducto de uva tinta y dos de sus principales componentes fenólicos, los ácidos gálico y siríngico, proporcionan una protección significativa a las células colónicas Caco-2 frente a estrés oxidativo. Extractos fenólicos de yerba mate y de café verde, así como sus principales ácidos hidroxicinámicos y metabolitos microbianos, impiden en estrés oxidativo inducido por la citoquina pro-inflamatoria TNF-α, atenuando la producción de ROS, disminuyendo la actividad de enzimas antioxidantes y la oxidación proteica, además de mejorar la actividad de eNOS en células endoteliales. En células cancerígenas, los extractos de café verde y especialmente de yerba mate disminuyeron la proliferación y viabilidad de forma tiempo- y dosis-dependiente. Sin embargo, los ácidos 5-cafeoilquínico y 3,5-dicafeoilquínico mostraron el efecto antiproliferativo más potente entre los compuestos estudiados. En definitiva, el subproducto de uva tinta, la yerba mate y el café verde presentan propiedades biológicas relevantes desde el punto de vista de la salud y, por tanto, gran potencial como ingredientes de alimentos funcionales o de nutracéuticos.