Uso de un circuito genético de retroalimentación positiva para el estudio de la señalización de la ruta de integridad celular de Saccharomyces cerevisiae y la identificación de nuevos antifúngicos

Resumen

Las rutas de transducción de señales mediadas por proteín quinasas activadas por mitógenos o MAPKs son esenciales para la viabilidad celular, porque detectan los cambios que se producen en el entorno extracelular y generan una respuesta adaptativa adecuada. Estas rutas están ampliamente distribuidas en las células eucarióticas, y se componen de un módulo de tres proteín quinasas que se activan por fosforilación secuencial. En general, el estímulo es detectado por sensores en la superficie celular que transducen la señal a los siguientes componentes de la ruta, normalmente una GTPasa y una proteín quinasa, que es la que activa al módulo de MAPKs. Finalmente, la MAPK activa fosforila a su vez a una serie de efectores, en su mayoría factores de transcripción, que dan lugar a la respuesta. El elevado grado de conservación de las rutas de MAPKs entre eucariotas hace de Saccharomyces cerevisiae un excelente modelo para su estudio. Esta levadura presenta cinco rutas mediadas por MAPKs, entre las que se encuentran la ruta de integridad de la pared celular o CWI (Cell Wall Integrity) y la de alta osmolaridad o ruta HOG (High Osmolarity Glycerol). Mientras que la segunda se encarga de la supervivencia celular en condiciones de estrés hiperosmótico, la primera es la responsable del mantenimiento de la integridad de la pared celular fúngica, estructura fundamental para las células de levadura, lo que la convierte en una buena diana de antifúngicos. Para estudiar la señalización a través de la ruta CWI, nuestro grupo desarrolló un circuito genético sintético de retroalimentación positiva denominado IPAC (Integrity Pathway Activation Circuit), cuya activación en condiciones de estimulación se traduce en la inhibición del crecimiento debida a la hiperactivación de la ruta CWI, de manera dependiente de la intensidad del estímulo. Esta amplificación de la señalización se potencia cuando se integra el circuito IPAC en el genoma de la levadura. Mediante el uso de esta herramienta genética, observamos que la exposición celular al detergente dodecilsulfato sódico (SDS) inducía la fosforilación de la MAPK de la ruta CWI Slt2. En este proceso participan, además del resto de elementos del módulo de MAPKs de esta ruta, el módulo de MAPKs de la ruta HOG constituido por Ssk2, Pbs2 y Hog1. Este modelo de activación secuencial de ambas rutas por SDS no implica la translocación de Hog1 al núcleo ni la activación transcripcional de la ruta HOG, pero podría estar favorecido por la interacción múltiple entre los componentes de ambos módulos de MAPKs. Por otro lado, hemos demostrado que la ruta CWI es necesaria para la supervivencia de las células de levadura en presencia del aminoglucósido neomicina. En la señalización inducida por este inhibidor de la síntesis proteica a través de la ruta CWI, además del eje Ssk2-Pbs2- Hog1, contribuyen la quinasa Pkh1 de la ruta de síntesis de esfingolípidos y la proteína de unión a PIP2 Slm1, que participa en la ruta de TORC2. Finalmente, siguiendo una estrategia de reposicionamiento de fármacos, se llevó a cabo un rastreo de la colección comercial de compuestos Prestwick Chemical Library empleando células con el circuito IPAC integrado para buscar moléculas que actuasen sobre la ruta CWI. De esta manera se identificaron 13 activadores y 27 inhibidores de la ruta, que en un futuro podrían utilizarse en terapia antifúngica, por alterar directamente la superficie celular del patógeno fúngico y por impedir el mecanismo compensatorio inducido por la ruta CWI, respectivamente. En este último caso, se podrían incluir en terapias combinadas con antifúngicos conocidos cuya diana sea la pared celular o la membrana plasmática. Por tanto, el circuito IPAC proporciona un método fiable y sencillo para la identificación de moléculas con potencial actividad terapéutica que actúen sobre la ruta CWI, bien activándola o bien inhibiendo su funcionamiento.