Bases moleculares de la interacción esticolisina-membrana sobre la estructura del poro y los efectos de los lípidos

Resumen

Las proteínas formadoras de poros (PFPs) son una clase de proteínas tóxicas. Como su propio nombre indica, su toxicidad se basa en su capacidad para formar poros, lo que hacen en membranas de composición apropiada. Como consecuencia, inducen un desequilibrio osmótico en las células sobre las que se han ensamblado, provocando la muerte celular. Las anémonas de mar son uno de los órdenes de animales capaces de producir PFPs. Estas toxinas son conocidas con el nombre de actinoporinas, y forman parte del veneno de las anémonas. Estructuralmente, se caracterizan por su pequeño tamaño, un plegamiento común que consiste en un sandwich beta flanqueado por dos hélices alfa, y por tener, generalmente, un punto isoeléctrico básico. Funcionalmente, actúan mediante el reconocimiento de esfingomielina (SM) en las membranas, hecho que desencadena la formación de poros selectivos de cationes. Dicho proceso se ve enormemente favorecido por la presencia de colesterol (Col). Sin embargo, el mecanismo por el que actúa el Col no está claro. Las esticolisinas, objeto de estudio de esta tesis, son las actinoporinas producidas por la anémona caribeña Stichodactyla helianthus. Aunque se conocen al menos tres isoformas, las dos más abundantes en el veneno de esta anémona son las esticolisinas I y II (StnI y StnII, respectivamente). A pesar de ser estructuralmente muy similares, compartiendo cerca del 93 por ciento de su secuencia de aminoácidos, la magnitud de su actividad es muy diferente cuando esta se cuantifica frente a eritrocitos. En esta tesis se comenzó por estudiar la interacción de StnI y StnII frente a membranas modelo de diferentes grosores, en presencia y en ausencia de colesterol. Los resultados obtenidos mostraron que la acción de ambas isotoxinas se veía favorecida en caso de que aquellas membranas tuvieran como componente mayoritario dioleil- o dipalmitoleil-fosfatidilcolina. Un sencillo modelo indica que la hélice amino terminal de StnI y StnII encaja perfectamente con dichos lípidos, los cuales son muy similares a los mayoritarios en las membranas de una gran variedad de peces. El tamaño de dichas hélices sería por tanto resultado de la selección natural. En el siguiente estudio se examinó el rol del Col en la formación de los poros de las esticolisinas. Para ello se emplearon StnII y una serie de mutantes de mutantes de triptófano de esta toxina en combinación con análogos fluorescentes de SM y Col. Los resultados sugieren que el Col hace que la SM sea más fácilmente reconocible por StnII. Además, determinamos que StnII es capaz de cambiar el microambiente del Col, haciendo que esté preferentemente distribuido cerca de StnII cuando esta se encuentra unida a la membrana. A continuación se abordó el proceso de formación de poro, en concreto el hecho de que los poros de StnII parecen cerrarse cuando se estudian usando ensayos de liberación de calceína encapsulada en vesículas modelo. En este caso, pudimos demostrar que los poros realmente permanecen abiertos una vez se forman usando una molécula pequeña como es el ditionito. Moléculas de mayor tamaño, como la calceína, solo son capaces de ser liberadas a causa de las perturbaciones de membrana ocasionadas por la formación de poros por parte de StnII, y no a través de los poros en equilibrio termodinámico. En un último estudio se desarrolló un método para medir la estequiometría de PFPs mediante transferencia de energía por resonancia haciendo uso de marcajes fluorescentes específicos. Así, se determinó que StnI es capaz de oligomerizar en disolución, proceso que está favorecido por la presencia de StnII. Se concluyó que la estequiometría de los poros de StnI es al menos de siete subunidades por poro, y que la estequiometría se mantiene si StnI forma heteroporos con StnII.