Novel treatment strategies for chronic respiratory infections based on the analysis of antimicrobial resistance dynamics in pseudomonas aeruginosa biofilms

Resumen

Pseudomonas aeruginosa es la principal causa de infecciones respiratorias crónicas (IRC) y el principal responsable de la elevada morbilidad y mortalidad de los pacientes con fibrosis quística (FQ). La instauración de la IRC requiere un complejo proceso adaptativo que incluye la selección de un número importante de mutaciones, necesarias para la persistencia a largo plazo y conlleva la transición desde el modo de crecimiento planctónico al de biopelícula, un sello distintivo de las infecciones crónicas. La compleja estructura espacial de las biopelículas junto con la presión selectiva de antibióticos, da lugar a la evolución de comunidades heterogéneas conformadas por diferentes subpoblaciones que coexisten e interactúan estableciendo diversos comportamientos sociales. Además, lo prolongados tratamientos antibióticos empleados en la IRC conllevan, inevitablemente, un aumento de la resistencia. Las estrategias terapéuticas tradicionales para controlar la infección por P. aeruginosa en pacientes con FQ están basadas en el uso de un único antibiótico nebulizado y parecen ser ineficaces con el paso del tiempo. En primer lugar, este trabajo determinó si los mutantes resistentes de P. aeruginosa mostraban comportamientos egoístas o altruistas al ser estudiado en biopelículas mixtas durante el tratamiento antibióticos. Se emplearon para el estudio de biopelículas simples o mixtas la cepa PAO1 marcada con ECFP y derivados marcados con EYFP que hiperproducían la β-lactamasa AmpC o la bomba de expulsión MexAB-OprM. Las biopelículas maduras fueron expuestas a diferentes concentraciones de β-lactámicos para monitorear la dinámica estructural, utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM) y la dinámica de poblacional, a través del recuento de células viables. Si bien el tratamiento con β-lactámicos de biopelículas formadas por PAO1 condujo a una reducción importante de la carga bacteriana, tuvo poco efecto sobre las biopelículas formadas por los mutantes resistentes. Sin embargo, el hallazgo más revelador fue que la carga bacteriana de PAO1 aumentó significativamente cuando se crecía en biopelículas mixtas en comparación con las biopelículas individuales. De acuerdo con los recuentos de células viables, las imágenes CLSM mostraron la amplificación de los mutantes resistentes y la protección sobre las poblaciones sensibles. Estos hallazgos demuestran por primera vez que los mutantes que expresan diversos mecanismos de resistencia, tanto hiperproducción de β-lactamasa como hiperexpresión de bombas de flujo, protegen a toda la comunidad, preservando a las poblaciones sensibles del efecto de los antibióticos. Por último, este trabajo también evaluó la eficacia terapéutica y la dinámica de la resistencia a los antibióticos en biopelículas expuestas a tratamiento secuencial con aztreonam (ATM) y tobramicina (TOB) simulando la terapia inhalada. Para su estudio se desarrollaron biopelículas de cepas clínicas y de laboratorio utilizando el sistema de celda de flujo. Las biopelículas maduras fueron tratadas con diferentes concentraciones de ATM y TOB y sus alternancias a diferentes tiempos. Se determinó tanto el número de células viables como de mutantes resistentes y se controló la dinámica estructural de las biopelículas mediante CLSM. La monoterapia con TOB produjo una intensa disminución de las células viables, que no siempre se correlacionó con una reducción de la biomasa y/o el efecto bactericida sobre las biopelículas, particularmente para las cepas de FQ. El efecto bactericida de la monoterapia con ATM fue menor, pero tuvo efecto sobre la biomasa y/o la estructura de las biopelículas, incluyendo un inteso efecto de filamentación. La alternancia de TOB y ATM supuso una mejora de la actividad antibiopelícula tanto frente a las cepas clínicas como de laboratorio, en comparación con los regímenes individuales, potenciando el efecto bactericida y/o la reducción de la biomasa. Estos resultados apoyan la evaluación clínica de regímenes secuenciales con antibióticos inhalados en la FQ, a diferencia de los tratamientos de mantenimiento actuales que emplean un solo antibiótico en monoterapia. En general, este trabajo proporciona nuevos conocimientos sobre la complejidad del desarrollo de resistencia en las biopelículas, destacando la importancia de los mutantes resistentes dentro de las poblaciones heterogéneas, y también representa un paso adelante para el desarrollo de nuevas estrategias que puedan combatir la IRC por P. aeruginosa.