Capacidad antioxidante y antirradicalaria, y nuevas lectinas selblo y ebulina blo presentes en las inflorescencias del saúco enano (sambucus ebulus l)

Resumen

S. ebulus es una planta medicinal con una gran capacidad antioxidante, y una elevada concentración de polifenoles, entre los que se incluyen los cianidín-glucósidos (Kiselova y cols., 2006). Se ha descrito que los frutos de S. ebulus pueden llegar a ser tóxicos, e incluso mortales para niños y ancianos y esto limita grandemente su utilidad (Font-Quer., 1999). Esta planta contiene una serie de proteínas denominadas ebulinas que se han caracterizado como proteínas inactivadoras de ribosomas del tipo II que presentan una toxicidad a tener en cuenta si la planta se utiliza con finalidad fitoterapéutica y sin procesar, es decir sin manipulaciones térmicas encaminadas a destruir su toxicidad. La primera parte de los objetivos de este trabajo ha estado encaminada precisamente a determinar la capacidad antioxidante y antirradicalaria presente en las distintas partes de la planta. Nuestros resultados indican que son los frutos las partes que tienen mayor concentración de compuestos que reaccionan con el reactivo Folin - Ciocalteau. Este reactivo es característico de fenoles y mide también capacidad antioxidante de compuestos como vitaminas E y C, y ácidos orgánicos como ácido clorogénico, cafeico, sinápico, etc. Los frutos maduros acumulan algo más de 4 veces compuestos reactivos con el reactivo Folin - Ciocalteau que los frutos verdes. Entre los fenoles complejos que reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteau se encuentran los flavonoides. Se acepta que los flavonoides son productos del metabolismo secundario producidos por la ruta del fenilpropano que podrían servir en la planta que los produce como protección frente a la luz ultravioleta, como agentes protectores frente al ataque por patógenos y como moduladores de la acción de las hormonas vegetales. La otra medida de capacidad antioxidante es la que utiliza el método CUPRAC, por este procedimiento se obtienen valores de capacidad antioxidante en frutos maduros 4,5 veces más que en frutos verdes y la mitad que con el reactivo de Folin - Ciocalteau. Aunque los fenoles poseen también capacidad antioxidante, la diferencia entre ambos procedimientos indica que el método del Folin - Ciocalteau valora además de los compuestos antioxidantes, otros compuestos sin capacidad reductora aparente del complejo cobre (II) - neocuproína. Otra propiedad importante de plantas medicinales con capacidad antioxidante, es que presentan actividad antirradicalaria y por lo tanto, son útiles para el atrapamiento de radicales libres generados en el metabolismo, particularmente radicales libres, el oxígeno, nitrógeno, fósforo y cloro. Estos radicales libres, de los cuales, los del oxígeno son los más conocidos (ROS: ¿radical oxigen species¿), atacan a las moléculas biológicas en particular los fosfolípidos de las membranas y los ácidos nucleicos. Muchas de las sustancias antirradicalarias que ingerimos se encuentran en los alimentos vegetales y en particular en determinadas plantas, muchas de ellas, plantas medicinales. En el presente trabajo se escogió el modelo del radical libre DPPH, que es estable en condiciones normales y presenta absorción a 515 nm. La presencia de sustancias antirradicalarias puede por tanto detectarse con esta sustancia simplemente valorando la reducción de la absorción. Este procedimiento es utilizado ampliamente en la literatura sobre el tema (Barros y cols., 2007). El DPPH tiene mayor utilidad para nuestro estudio que el DOPPH. En los experimentos se utilizó el Trolox, que es un análogo de la vitamina E, como patrón. Los resultados indican que los frutos maduros de nuevo, presentan el doble de actividad antirradicalaria. La maduración de los frutos de S. ebulus es concomitante con la biosíntesis de antocianos en particular los derivados de cianidina, cianidín-3-glucósido, cianidín-3-glucósido-5-sambubiósido y cinanidín-5-diglucósido (Bermúdez-Soto y Tomás-Barberán., 2004), siendo más abundante el primero. La biosíntesis se produce por la ruta de la chalcona sintetasa y la transición verde maduro se produce muy rápidamente, de manera, que es posible encontrar simultáneamente frutos verdes y maduros en la misma umbela. Nuestros resultados indican que la única parte de la planta que acumula antocianos son los frutos maduros, mientras que las demás partes estudiadas prácticamente carecen de ellos. La determinación de la concentración de antocianos se realizó mediante el método diferencial del pH, que consiste en determinar la absorción diferencial que se produce a pH 1 (coloración rojiza) y a pH 4,5 (de coloración muy pronunciada). Los valores obtenidos en equivalentes de cianidín-3-glucósido son muy elevados (2,1 mg/gr de fruto maduro), lo que les convierte en las bayas conocidas más ricas en este compuesto. El análisis por HPLC de los extractos crudos de frutos maduros confirma que el cianidín-3-glucósido, es el glucósido más abundante. Por contra, los frutos verdes y las inflorescencias presentan un pico de absorción mayoritario que no hemos podido identificar pero que se mueve en la zona del cianidín-3,5-diglucósido (Bermúdez-Soto y Tomás-Barberán., 2004). El tratamiento térmico reduce en 1/3 la concentración de cianidín-3-glucósido ya a los 5 minutos y de 1/2 a los 15 minutos, y desaparece prácticamente a los 60 minutos. Esto demuestra que este antociano es más sensible que el conjunto de los antocianos y de antioxidantes, que experimenta pérdidas inferiores al 10% en los primeros 15 minutos del tratamiento. No hay que olvidar que entre las sustancias antioxidantes de los frutos maduros se encuentran vitamina C, vitamina E y sustancias polifenólicas que pueden llegar a ser más resistentes que los antocianos. La limitación en el uso de estas bayas como fuente rica en antocianos y otros polifenoles y antioxidantes, estriba en la presencia de lectinas cuya concentración depende del grado de maduración entre otros factores. Resultados recientes indican que las lectinas de frutos de S. ebulus, ebulina f y SELfd, se sensibilizan a pepsina ácida por incubación en baño de agua en ebullición durante 5 minutos (Cabrero y cols., 2013). En este trabajo se estudió si dicho tratamiento térmico, que inactivaría las lectinas en el proceso de digestión gástrica, y por tanto, reduciría su toxicidad y alergenicidad, afectaría a la concentración de fenoles totales, capacidad antioxidante y capacidad antirradicalaria. Nuestros resultados indican que este tratamiento térmico que sensibilizan las lectinas a pepsina no elimina las propiedades antioxidantes y antirradicalarias de los extractos de fruto maduro. La baja sensibilidad de la ebulina l y su ausencia en la SELfd de frutos probablemente se debe a la conformación y de las cadenas polipeptídicas que no permite el acceso de la pepsina a sus enlaces peptídicos diana. El tratamiento térmico desnaturaliza a las lectinas y permite su rápida degradación por pepsina ácida. Las lectinas nativas, que como hemos comentado, guardan una estrecha homología con el alérgeno Sam nI pasarían intactas el compartimento gástrico y podrían desencadenar la respuesta alergénica en el intestino delgado. Por otro lado, dado que la ebulina f presenta una toxicidad apreciable cuando se administra por vía oral (Jiménez y cols. 2013b) es concebible que la ingesta de los frutos maduros sin procesar pudiera desencadenar la toxicidad que se ha observado en animales intactos (Jiménez y cols. 2013a). La relevancia de nuestros resultados estriba principalmente en que hemos podido demostrar que se puede reducir o eliminar la amenaza de ebulina f sin afectar las propiedades que se han asignado a los frutos de S. ebulus. S. ebulus contiene ebulina en hojas (Girbés y cols., 1993 a, b), rizomas (Cítores y cols., 1997), y frutos (Cítores y cols., 1998 y Jiménez y cols. 2013b). Dada la importancia de esta proteína y su carácter tóxico (Jiménez y cols. 2013a) decidimos estudiar su presencia en distintas partes de la planta. Resulta muy interesante el hecho de que estas proteínas se encuentren entre las mayoritarias en las distintas partes de S. ebulus en particular en inflorescencias, frutos verdes y maduros, umbelas y hojas. La mayor concentración de lectinas en particular SELfd se produce en inflorescencia y en frutos. Aunque no se sabe el papel biológico de estas proteínas debe de ser importante habida cuenta de su importancia. Peumans y Van Damme., (1995) han sugerido que las proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo II y particularmente las que poseen actividad lectina, así como las lectinas sin actividad antirribosómica podrían desempeñar un papel como proteínas de reserva para almacenar nitrógeno biodisponible rápidamente. En el caso de los frutos maduros, la lectina SELfd representa más del 95% de la proteína total y presenta trazas de ebulina f. En los frutos verdes se produce también acumulación de la lectina pero en menor cantidad que en frutos maduros. En inflorescencias se acumulan dos lectinas parecidas a SELfd y ebulina f, que hemos denominado SELblo y ebulina blo (de ¿blossoms¿). Para determinar si las lectinas de las inflorescencias son las mismas que las de los frutos, procedimos a su aislamiento según la metodología desarrollada previamente por nuestro laboratorio (Jiménez y cols. 2013b) ambas lectinas SELblo y ebulina blo pudieron aislarse de la misma manera que SELfd y ebulina f. Recientemente se ha aislado nigrina b de la corteza de S. nigra, mediante un proceso que requiere una primera columna de cromatografía de intercambio iónico en SP-Sepharose, posterior elución con tampón fosfato sódico y una cromatografía de exclusión molecular en Sephacryl S-100 (Ferreras y cols., 2011). Este procedimiento que es distinto del de afinidad rinde 4 veces más ebulina que el procedimiento original por cromatografía de afinidad (Girbés y cols., 1993a). No obstante, este procedimiento de intercambio iónico rinde cadenas polipeptídicas que pueden ser inactivas porque el procedimiento no las separa por actividad de fijación de azúcares. El resultado es importante si se utiliza esta proteína para la construcción de inmunotoxinas y conjugados dirigidos contra células blanco (Muñoz y cols., 2007; Muñoz y cols., 2013). En estos casos lo que se necesita es una proteína muy activa tanto en su parte antirribosómica (cadena A) como en su parte lectina (cadena B). Se ha descrito que la internalización de las RIPs de tipo II se produce con mayor eficiencia en forma de dímero A-B, en el cual la cadena B ayuda al proceso de traslocación a través de las membranas endosómicas y en su caso del retículo endoplásmico rugoso, como sucede con la ricina. La estabilidad de las inmunotoxinas construidas con dímeros con RIPs A-B, es mayor que las construidas con cadenas A purificadas a partir de dímeros A-B o proteínas recombinantes derivadas del gen que codifica a la cadena A de las RIPs de tipo II (Antolín y cols. 2004). El análisis de las masas moleculares obtenidas por espectrometría de masas revela que ebulina blo posee una masa relativa de 63.225, diferente de la masa relativa de ebulina f que es de 58.904. Por otro lado, la masa molecular de SELblo es muy parecida a la de SELfd (68.432 en el primer caso y 68.678 en el segundo). Ebulina blo y SELblo presentan un comportamiento electroforético diferente. Así ebulina blo en presencia de 2-mercaptoetanol se comporta como dos bandas de peso molecular diferente (cadenas A y B) que estuviesen glicosiladas y por lo tanto, migran como bandas anchas más definida en la parte superior. Este comportamiento se ha apreciado en otras glicoproteínas, en cambio, SELblo presenta una única banda nítida consistente con una estructura B*-B*. El comportamiento electroforético de SELblo es también característico de proteínas muy glucosiladas. Tradicionalmente se ha aceptado que las cadenas polisacáridas de las glucoproteínas son más antigénicas que las cadenas polipeptídicas de las mismas glucoproteínas. Esto sugiere que la lectina de las inflorescencias puede ser un alérgeno notable lo que encajaría con hipótesis previas (Jiménez y cols., 2013b). En este sentido, hay que recordar que el alérgeno Sam nI, aislado del polen de S. nigra guarda homología secuencial con las lectinas de S. ebulus y S. nigra (Föster-Walde., 2003). La digestión con tripsina seguida de la espectrometría de masas permite obtener la huella tríptica de las dos lectinas que es claramente diferente. Por otro lado, la comparación con las dos lectinas obtenidas de frutos, indica que si bien, en el caso de SELblo, se obtiene un péptido mayoritario (1.884 Da) que se observa también en SELfd, es difícil encontrar péptidos equivalentes entre ambas lectinas. Una comparación similar entre la ebulina f y la ebulina blo, revela un péptido de 1.539 Da en ambas proteínas. Se secuenciaron diversos péptidos trípticos para tener la secuencia de aminoácidos y poder comparar con la secuencia de aminoácidos derivada del gen de la ebulina l (Pascal y cols., 2001) y de la SNAld de la base de datos NCBI Viridiplantae (Green plants) database. Los resultados indican que estas proteínas se parecen entre sí, en la cadena B y B*, y también con péptidos trípticos derivados del alérgeno Sam nI. Este hecho junto con la gran reactividad de la lectina SELblo apoya la hipótesis de que las lectinas antirribosómicas, por su cadena B, y las lectinas sin actividad antirribosómica (cadenas tipo B) configuran una familia de alérgenos siendo Sam nI el primero de los aislados (Ferreras y cols., 2011 y Jiménez y cols., 2013b). Resultados recientes indican que la ebulina aislada de frutos, ebulina f presenta una elevada toxicidad en ratones tanto por administración intraperitoneal como por administración oral (Jiménez y cols., 2013a, b). Dado que, el alérgeno Sam nI se aisló de polen y nuestra tesis es que las lectinas de las inflorescencias son alérgenos equivalentes y/o relacionados, se pensó que estas proteínas podrían tener toxicidad por administración nasal. Se estudió únicamente la ebulina blo porque es la lectina antirribosómica, y en forma de solución que se instiló por vía nasal para evitar la formación de aerosoles que, dada la toxicidad de las ebulinas, podría entrañar un serio peligro. A este respecto hay que recordar que la ricina es un arma de guerra del grupo B, que se utilizaría como aerosol dada su gran toxicidad por vía nasal (Griffiths, 2011). Recientemente los medios de comunicación se han hecho eco de diversos ataques a políticos en E.E.U.U. con cartas que contenían ricina. Según se ha demostrado recientemente, la toxicidad de ebulina f administrada por vía oral es mayor que la de la ricina administrada por la misma vía (Jiménez y cols. 2013b). En contraste es mucho menos por vía intraperitoneal, lo cual se ha interpretado en base a la vía de internalización de las proteínas inactivadoras de ribosomas nigrina b (Battelli y cols., 2004) y ebulina l (Svinth y cols., 1998). Ebulina blo presenta una alta toxicidad nasal que es patente por encima de los 2,5 mg/kg. Debido a la forma de instilación, como solución acuosa, cabría la posibilidad de que parte de la solución pasase al estómago. Sin embargo esta posibilidad puede descartarse por dos factores: 1) la ebulina es sensible a la degradación por pepsina ácida; 2) la toxicidad por vía nasal es similar a la vía oral por lo que pequeñas cantidades desviadas al estómago no deberían tener efecto ya que a 2,5 mg/kg por vía oral no se observa mortalidad. La combinación de ambos factores hace muy improbable que la ebulina blo nasal ejerza toxicidad a través del estómago. Se puede observar un efecto dependiente de la dosis, dado que a 3,75 mg/kg algunos animales mueren a los 7 días y a 5 mg/kg algunos lo hacen ya a los 5 días.