N-acilhomoserina lactona acilasa de Actinoplanes utahensiscaracterización e interés biotecnológico

Resumen

Las N-acilhomoserina lactonas AHLs son moléculas señalizadoras implicadas en los mecanismos de comunicación intercelular, conocidos como Quorum Sensing QS, en bacterias Gram negativas. Estos mecanismos de QS tienen un papel fundamental en la sincronización de la expresión génica dentro de comunidades bacterianas, permitiéndoles responder de manera dependiente de la densidad celular a cambios en el ambiente. Diversas funciones biológicas como formación de biofilms o la producción de factores de virulencia están reguladas mediante QS. La interferencia del QS, o Quorum Quenching QQ, es una interesante terapia antimicrobiana alternativa al uso antibióticos para inhibir los mecanismos de virulencia de bacterias patógenas sin afectar directamente a su crecimiento celular. Entre las diferentes estrategias de QQ que se pueden utilizar se encuentra la degradación o modificación enzimática de los autoinductores, y entre las enzimas capaces de degradar AHLs se encuentran las acilasas. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio y caracterización de la enzima N-acilhomoserina lactona acilasa de Actinoplanes utahensis AuAHLA y de su potencial interés biotecnológico. En primer lugar, se ha llevado a cabo la expresión heteróloga de AuAHLA y su purificación mediante cromatografía de intercambio iónico. Además, se ha llevado a cabo la caracterización de su estructura secundaria y terciaria. AuAHLA pertenece a la superfamilia de las Ntn-hidrolasas y presenta una estructura heterodimérica formada por una subunidad alfa de 20 kDa y una subunidad beta de 66,4 kDa con una serina como residuo catalítico nucleófilo N-terminal. Asimismo, se ha llevado a cabo su caracterización bioquímica y funcional, determinándose los parámetros cinéticos para la hidrólisis de diferentes penicilinas naturales y AHLs y estableciendo sus condiciones óptimas de actividad acilasa en 45 °C y pH 8,0. AuAHLA es capaz de hidrolizar diferentes penicilinas naturales y AHLs de entre 6 y 12 átomos de carbono en su cadena lateral, tanto alifáticas como con sustitución 3-oxo, siendo su sustrato preferido la penicilina V seguida de C12-HSL. Su eficiencia catalítica para la hidrólisis de AHLs disminuye al disminuir la longitud de la cadena alifática y en presencia de la sustitución 3-oxo. En este trabajo también se ha evaluado la actividad QQ de AuAHLA, analizando el efecto de la enzima sobre distintos procesos regulados por QS. En presencia de AuAHLA se reduce la producción de factores de virulencia piocianina y actividad proteasa en el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa, dando lugar además a la expresión diferencial de genes implicados en sistemas de QS y de genes regulados por QS. Asimismo, AuAHLA inmovilizada disminuye la rugosidad y el espesor de biofilms de P. aeruginosa, así como la formación de estructuras celulares complejas. La presencia de AuAHLA inmovilizada también afecta a la diversidad de biofilms formados por comunidades microbianas complejas procedentes de muestras de licor mezcla de un sistema MBR de tratamiento de aguas residuales. Por otro lado, las acilasas también son utilizadas como biocatalizadores en la producción de antibióticos beta-lactámicos semisintéticos en la industria farmacéutica. En este sentido, esta enzima también podría utilizarse en la síntesis enzimática de AHLs tanto naturales como semisintéticas, proceso que actualmente se lleva a cabo mediante síntesis química. En el presente trabajo se ha demostrado que AuAHLA es capaz de catalizar la síntesis cinéticamente controlada de penicilina V, distintas AHLs naturales biológicamente activas y del compuesto fenoxiacetil homoserina lactona POHL, un análogo no natural de AHLs. Además, se ha llevado a cabo la inmovilización de AuAHLA mediante unión covalente a soportes comerciales activados con grupos epóxido Sepabeads EC-EP y Lifetech ECR8204F y perlas de agarosa activadas con divinilsulfona, dada la importancia de la reutilización de los biocatalizadores a nivel industrial.