GlicobiotecnologíaEstructura 3D y mecanismos moleculares de especificidad en enzimas que modifican carbohidratos

Resumen

El uso de enzimas como biocatalizadores en la industria biotecnológica supone una alternativa sostenible a la química tradicional. En concreto, las glicosil hidrolasas estudiadas en este trabajo intervienen en la modificación de azucares y/o en las etapas finales de deconstrucción de grandes polisacáridos (quitina, hemicelulosa o almidón). Esto permite su empleo en los procesos de revalorización de productos de deshecho y su conversión en productos de valor añadido (oligosacáridos prebióticos). Además, entre las numerosas aplicaciones de las glicosil hidrolasas, destaca su capacidad de hidrolizar lactosa, la glicosilación de moléculas con interés farmacológico, la reducción de residuos contaminantes en la industria del papel y la producción de biocombustibles. En el Capítulo 1 se ha realizado un estudio estructural por medio de las técnicas de Cristalografía de rayos X y Criomicroscopía electrónica de la ß-galactosidasa de Thermotoga maritima de la familia GH2. Se ha descrito la disposición de un sexto dominio adicional en el extremo C-terminal, responsable de la formación de un ensamblaje más complejo dentro de esta familia de proteínas (octámero biológico), y posiblemente de su termorresistencia. Conocer su estructura nos ha facilitado el diseño de quimeras para su inmovilización mediante la adición de módulos de unión a carbohidratos (CBMs). En el Capítulo 2 se ha llevado a cabo el estudio cristalográfico de dos xilanasas, una de tipo exo- de la familia GH8 (Rex8A de Paenibacillus barcinonensis BP-23) y otra de tipo endo- de la familia GH10 (Xyn11 de Pseudothermotoga thermarum). Estas enzimas participan en la degradación de la hemicelulosa y presentan numerosas aplicaciones industriales, entre las que destacan la producción de biocombustibles, la fabricación del papel y la síntesis de xilooligosacáridos (XOS). Se logró capturar la enzima Rex8A unida a xilooligoméros lineales ß(1-4) y a xilanos ramificados con arabinosa, tanto en la posición O2 como en el O3 de la xilosa en -2. Además, se hicieron ensayos de mutagénesis dirigida para convertirla en una endoxilanasa, aunque no se consiguió revertir su actividad exo-. Se resolvió la estructura de Xyn11 y se comprobó que una suma de propiedades relacionadas con su estructura primaria y terciaria pueden contribuir a su estabilidad frente altas temperaturas y alcalinidad. En el Capítulo 3 se describe el estudio de dos quitinasas de la familia GH18 de Trichoderma harzianum, una de tipo exo- (Chit42) y otra de tipo endo- (Chit33), relacionadas con las síntesis de quitooligosacáridos (COS). La resolución estructural de tres complejos de Chit42 con oligosacáridos de cuatro y seis unidades de N-acetilglucosamina propuso, por primera vez, un mecanismo dinámico de unión de sustrato y liberación de producto, asociado al movimiento oscilatorio del dominio de inserción CID. Además, gracias a su estudio estructural se diseñaron variantes como R295S, E316S o E316A con actividad mejorada frente a diferentes sustratos. Además, se logró cristalizar Chit33 en complejo con un sustrato de cuatro unidades de N-acetilglucosamina que ha permitido proponer una serie de mutaciones puntuales con el fin de modular su actividad. En el Capítulo 4 se estudian dos ß-fructofuranosidasas de levadura de la familia GH32. Con respecto a la de Schwanniomyces occidentalis (SoFfase), se demostró la capacidad de transferencia de fructosa a diferentes alditoles asociada al par Q228/N254. En cuanto a la ß-fructofuranosidasas de Rhodotorula dairenesis (RdINV), hemos resuelto la estructura y sus complejos con tres ligandos, lo que nos ha permitido proponer mutaciones puntuales que modulen la actividad en la síntesis de fructooligosacáridos (FOS) y de otros compuestos glicosilados. En el Capítulo 5 presentamos la estructura de la ¿-glucosidasa de Schwanniomyces occidentalis (GAM1) de la familia GH31 y algunas de las perspectivas futuras para promover la síntesis de isomaltooligosacáridos (IMOS).