Desarrollo de técnicas inmunoenzimáticas con anticuerpos recombinantes y de técnicas de PCR en tiempo real para la detección de almendra y nuez de Brasil en alimentos

Resumen

La detección de frutos secos alergénicos en distintos tipos de alimentos es primordial para garantizar la salud de los individuos sensibles, ya que la ingesta inadvertida de pequeñas cantidades de estos alérgenos podría provocarles reacciones adversas e incluso la muerte. Las técnicas analíticas para su detección se basan en el análisis de proteínas o del ADN, pero no se disponía de métodos adecuados para la detección de todos los frutos secos alergénicos de declaración obligatoria en la Unión Europea. El objetivo global de esta tesis doctoral ha consistido en el desarrollo de novedosas técnicas de ELISA con anticuerpos recombinantes y de PCR en tiempo real que permitieran la detección sensible y específica de nuez de Brasil y almendra en alimentos. Este trabajo ha sido pionero en la obtención de nuevas sondas de afinidad para la detección de frutos secos alergénicos. Utilizando la tecnología de phage display y las genotecas Tomlinson I y J se han obtenido fago-anticuerpos de tipo scFv específicos frente a la nuez de Brasil y la almendra, con los que se han desarrollado técnicas de ELISA indirecto para la detección de estos alérgenos en alimentos, con límites de detección de 5,0 y 0,1 mg por gramo, respectivamente. Utilizando una aproximación proteómica se han identificado las globulinas 11S de la nuez de Brasil y de la almendra como las proteínas diana reconocidas por los anticuerpos recombinantes obtenidos frente a estas especies. Además, el análisis de numerosos productos comerciales tales como productos de panadería y bollería, galletas, chocolates, barritas energéticas, helados, cremas para untar y bebidas, mediante las técnicas de ELISA desarrolladas ha permitido descubrir errores o fraudes de etiquetado y detectar almendra y nuez de Brasil en productos en los que no se advierte de su presencia. La obtención de anticuerpos recombinantes frente a varios frutos secos de declaración obligatoria supone un avance importante desde el punto de vista metodológico, puesto que estas nuevas sondas de afinidad no requieren la utilización de animales de experimentación y constituyen una fuente ilimitada de anticuerpos específicos. Finalmente, una vez obtenidos los anticuerpos recombinantes se consiguió modificar mediante ingeniería genética los fragmentos scFv específicos frente a almendra y expresarlos en un sistema eucariota con el fin de producir scFv biotinilados in vivo. La estrategia desarrollada para la biotinilación in vivo de proteínas recombinantes empleando la levadura Pichia pastoris es una de las aportaciones más novedosas de esta tesis. Tras su purificación y multimerización con un núcleo de avidina-peroxidasa, los scFv biotinilados y utilizados en una técnica de ELISA conservaron la capacidad de detectar proteína de almendra hasta 470 mg por kg. En cuanto al desarrollo de técnicas genéticas, en esta tesis doctoral se han desarrollado técnicas de PCR en tiempo real para la detección de nuez de Brasil y almendra, que se encuentran entre las más sensibles publicadas en la bibliografía, con niveles de detección en alimentos de 2,5 y 0,1 mg por kg respectivamente, por lo que tienen una gran utilidad práctica para el control de alérgenos y la verificación del etiquetado, tanto para las autoridades sanitarias como para las industrias alimentarias. Los cebadores y sondas desarrollados han permitido analizar un gran número de alimentos comerciales y poner de manifiesto la presencia de frutos secos alergénicos no declarados en un elevado porcentaje de muestras, que oscila entre un 10 por ciento en el caso de la nuez de Brasil y un 40 por ciento en el caso de la almendra. Puede concluirse que las técnicas desarrolladas en este trabajo proporcionan herramientas específicas, rápidas y sensibles para detectar la presencia de nuez de Brasil y almendra, contribuyendo al cumplimiento de la normativa europea en materia de etiquetado de los alimentos.