Evaluación "In vitro" e "in vivo" de la seguridad de nanopartículas de plata

Resumen

El objetivo principal de este trabajo de investigación ha consistido en. Evaluar los riesgos toxicológicos de nanopartículas de plata AgNPs de diferentes tamaños en líneas celulares humanas y en Drosophila melanogaster. Así como, en determinar los posibles mecanismos de acción por los que estas AgNPs ejercen su efecto tóxico. Primeramente, se caracterizaron las AgNPs de tamaño 4.7, 42 y 157 nm utilizando el microscopio electrónico de transmisión y la dispersión de luz dinámica. Las AgNPs de 4.7 y 42 nm presentaron una morfología esférica, de múltiples facetas y bien dispersas, mientras que las AgNPs de 157 nm presentaron una morfología más ovalada. El tamaño primario de las AgNPs coincidió con el proporcionado por el fabricante, excepto en las AgNPs de 157 nm en las cuales obtuvimos un tamaño ligeramente menor al del proveedor. Por otra parte, se observó la aglomeración de las AgNPs después de la incubación de las mismas a 37ºC durante 24 horas en medio de cultivo libre de células. Para evaluar la citotoxicidad inducida por las AgNPs de 4.7, 42 y 157 nm se utilizaron líneas celulares humanas: hepatoma HepG2, leucemia HL-60, fibroblastos de piel NHDF y fibroblastos de pulmón HPF, empleando los métodos MTT y LDH. Las AgNPs de 4.7, 42 y 157 nm disminuyeron significativamente la viabilidad celular de manera dosis y tiempo dependiente en las cuatro líneas, excepto las de 157 nm en las células NHDF. El daño al ADN de las AgNPs de 4.7 y 42 nm en las células HepG2, HL-60, NHDF y HPF se evaluó utilizando el ensayo Cometa, incluyendo además una modificación con las enzimas formamidopirimidina-DNAglicosilasa y endonucleasa III, que reconocen las purinas y las pirimidinas oxidadas, respectivamente. Ambas AgNPs indujeron una ruptura significativa de las cadenas de ADN en las cuatro líneas celulares. Además, se observó un incremento del daño oxidativo al ADN, excepto en las células HPF tratadas con las AgNPs de 42 nm. La genotoxicidad de ambas AgNPs también fue evaluada in vivo empleando el ensayo de mutación y recombinación somática en alas de Drosophila Melanogaster. Ninguna de las dos AgNPs indujeron un incremento en la frecuencia de clones mutantes. Sin embargo, observamos defectos en la pigmentación de la cutícula y reducción de la capacidad de movimiento de las moscas, sugiriendo una respuesta frente al estrés oxidativo. Posteriormente, se utilizó el diacetato de 2¿,7¿-diclorodihidrofluoresceína para detectar la producción intracelular de las especies reactivas del oxígeno EROs inducida por las AgNPs de 4.7 y 42 nm en las cuatro líneas celulares y la N-acetilcisteína NAC como antioxidante. La producción de las EROs aumentó después de la exposición de las células a las AgNPs. El pretratamiento con la NAC inhibió la citotoxicidad inducida por las AgNPs de 4.7 y 42 nm. Además, ambas AgNPs provocaron una drástica disminución del contenido total de glutatión en las cuatro líneas celulares, y una reducción de los niveles de SOD aunque no fue estadísticamente significativa. Finalmente, determinamos la inducción de apoptosis por las AgNPs de 4.7 y 42 nm en las líneas HepG2 y HL-60, utilizando la microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo ensayo Anexina V/IP, TUNEL y activación de caspasas. La apoptosis inducida por las ambas AgNPs fue dependiente de la activación de las caspasas en ambas líneas celulares, actuando las caspasas -3 y -7 como caspasas efectoras. En conclusión, las AgNPs de 4.7 y 42 nm son citotóxicas y genotóxicas en las líneas celulares HepG2, HL-60, NHDF y HPF. El efecto tóxico de las AgNPs es dependiente del tamaño, presentando las más pequeñas un potencial tóxico mayor. Además, el efecto tóxico de las AgNPs depende de la línea celular, siendo las células HepG2 las más sensibles. El principal mecanismo de toxicidad de estas AgNPs es el estrés oxidativo, a través de la producción de las EROs y la reducción de enzimas y moléculas antioxidantes. Ambas AgNPs indujeron apoptosis dependiente de caspasas.