Simulación y control de biofilms portadores de "Listeria monocytogenes" en la industria alimentaria

Resumen

Caracterizar la interacción entre P. fluorescens, aquí Pf, y L. monocytogenes, aquí Lm, en biofilms, aquí BF, mixtos a temperatura ambiente y refrigeración. Evaluar la capacidad para persistir de distintas Lm en relación con su capacidad para desarrollar BF y determinar parámetros estructurales relevantes. Analizar los daños de las células adheridas de Lm por exposición a quitosano y su posterior recuperación, tanto a nivel de densidad celular como estructural. También, valorar el quitosano como agente de limpieza y desinfección de los BF en la industria alimentaria, aprovechando su impacto sobre la estructura.Para estos fines se seleccionaron 10 cepas de Lm: la cepa Scott A como referencia, 6 persistentes y 3 esporádicas aisladas de industria cárnica, y la cepa Pf ATCC 948TM para formar BF puros y mixtos con cada una de las cepas de Lm, iniciando los cultivos a un nivel de cada una de las especies de 104 UFC¿ml-1.Para la formación de BF se empleó un sistema en batch, con cupones de vidrio desechables semisumergidos como soporte para la adhesión y dos temperaturas, 20°C y 4°C, para obtener BF templados y fríos. Los BF se sumergieron en quitosano al 1 por ciento durante 1h y para la recuperación, los cupones tratados se revitalizaron en medio fresco a 20°C durante 48h. La densidad celular adherida antes, después y durante la revitalización se determinó mediante siembra en medios generales o selectivos, en el caso de los BF mixtos. Para la determinación de la biomasa adherida por densitometría, los BF fueron teñidos con azul de coomassie. Para las observaciones de la estructura mediante microscopía confocal láser de barrido las muestras se tiñeron con distintos fluorocromos, procesándose las imágenes obtenidas mediante el software Imaris 8.2. El tratamiento estadístico de los datos se hizo con el software Statgraphics Centurion. Aunque Lm logra formar BF monoespecie, la presencia de Pf modifica esta capacidad según la cepa de Lm. Cuando se estudió la influencia de la persistencia, se encontró una peor compatibilidad con Pf en las cepas esporádicas. La compatibilidad de las cepas persistentes varió según cepa y temperatura. Se ha identificado la tendencia de Lm a ocupar las regiones más profundas en los BF mixtos, observándose una estructura estratificada, independiente de la temperatura. La estructura en los BF mixtos fríos, fue particularmente compacta. La biomasa, como suma de células viables, no viables y matriz, fue menor en los BF mixtos fríos que en los templados, aún con densidad de población similar. Se han observado en los BF cambios por envejecimiento que aumentan presumiblemente la tolerancia a los antimicrobianos. La tolerancia al quitosano dependió del tipo de BF y de la cepa de Lm. El efecto antiBF del quitosano afectó a la viabilidad celular y a la estructura, causando lesiones de decenas de micras de diámetro. Tras 24h de incubación, la población de Lm en los BF residuales recuperó los niveles previos al tratamiento, viéndose, la velocidad de recuperación aumentada por la presencia de Pf y disminuida por el estrés por frío durante el desarrollo de los BF. La presencia de Pf y las bajas temperaturas modificaron el comportamiento de Lm en cuanto a capacidad para formar BF, tolerancia al quitosano y posterior velocidad de recuperación, encontrándose relación entre estos efectos y determinadas modificaciones en estructura, matriz y distribución de las dos especies. La capacidad para persistir de Lm, parece responder a un balance entre factores intrínsecos y extrínsecos, siendo la contribución de los primeros mayor en las cepas persistentes y la de los segundos, esencial para las esporádicas. La capacidad del quitosano para aumentar la accesibilidad a las células del BF, le convierte en una herramienta potencialmente eficaz para controlar los BF en la industria alimentaria.