Factores de virulencia e identificación, caracterización bioquímica y genética y producción heteróloga de bacteriocinas producidas por enterococos aislados de palomas torcaces (columba palumbus)

Resumen

En esta Tesis Doctoral enterococos aislados del contenido intestinal y canales de palomas torcaces (Columba palumbus) se han evaluado por su actividad antimicrobiana, por la presencia de genes que codifican bacteriocinas y su expresión proteica, y por la de genes que codifican factores potenciales de virulencia. El mayor porcentaje de enterococos con actividad antimicrobiana fue de la especie Enterococcus faeclum, seguido de Enterococcus faecalis y Enterococcus columbae. El gen efaAfm fue el único determinante de virulencia identificado en E. faecium, mientras que los aislados de E. faecalis poseían un mayor número de factores de virulencia y los de E. columbae no mostraron ninguno de los determinantes de virulencia evaluados. Aunque los aislados de E. faecalis mostraron una marcada actividad antimicrobiana directa, su actividad antimicrobiana no pudo detectarse en los sobrenadantes de los cultivos productores. Seguidamente se caracterizó bioquímica y genéticamente la bacteríocina de E. columbae PLCH2, aislado del contenido intestinal de palomas torcaces (Columba palumbus). La secuencia aminoacidica parcial de la bacteriocina purificada, obtenida por degradación de Edman, reveló una elevada homologia con la secuencia aminoacidica de la bovicina HJ50, un [antibiótico producido por Streptococcus bovis HJ50. La secuenciacíón nucleotídíca de una región de 601 -pb de E. columbae PLCH2 mostró la presencia de dos marcos de lectura abiertos (ORFs) consecutivos. El primer orf (colA) codifica un prepropéptido de 58 aminoácidos, compuesto de una secuencia lider de 25 aminoácidos seguida por un propéptido de 33 aminoácidos que, tras su modificación posttraduccional, dará lugar a la bacteriocina madura, denominada columbicina A (ColA). Un segundo orí (orf2) de secuencia incompleta se localizó inmediatamente por debajo del gen estructural de la ColA. Finalmente y, para concluir con los objetivos propuestos en esta Tesis Doctoral, se evaluó la producción y expresión funcional de la enterocina A (EntA), producida por E. faecium PLBC21, y de la pediocina PA-1 (PedA-1), producida por P. acidilactici PLBH9, en L. lactis. Para ello se sustituyó la secuencia lider de laEntA, sintetizada por E. faecium PLBC21, por el péptido señal de la enterocina P (EntP), una bacteriocina sec-dependiente producida por E. faecium P13, lo que permitió ia producción de la EntA en L. lactis subesp. cremoris NZ9000 y L. lactis subesp. lactis IL1403 y la co-producción de nisina A (NisA) y EntA por L. lactis subesp. lactis DPC5598. El fragmento génico de la EntA madura fusionada al péptido señal de la EntP constituyó el requerimiento minimo necesario para la síntesis, transporte y secreción de la EntA biológicamente activa en L lactis. La producción y actividad antimicrobiana de la EntA sintetizada por algunas cepas de L. lactis fue mayor que la de las cepas control de E. faecium. Finalmente, y con respecto a la producción heteróloga de la PedA-1, la construcción de quimeras génicas de la PedA-1, una bacteriocina producida por P. acidilactici PLBH9, fusionada al péptido señal EntP permitió la producción de PedA-1 en los sobrenadantes de L. lactis subesp. cremoris NZ9000 y L. lactis subesp. lactis IL1403 y la co-producción de NisA y PedA-1 en L. lactis subesp. lactis DPC5598. La PedA-1 purificada de L. lactis IL1403 (pMPP9) mostró una masa molecular idéntica a la de la purificada de una cepa control de P. acidilactici, lo que sugiere que la síntesis, transporte y secreción de la PedA-1 tiene lugar en L lactis. Sin embargo, la producción y la actividad antimlcrobiana de la PedA-1 producida por las cepas de L. lactis fue menor que la producida por las cepas control de P. acidilactici.