Utilización de técnicas de PCR y de PCR en tiempo real para la identificación de especies animales en mezclas lácteas y quesos

Resumen

En esta tesis doctoral se ha planteado la identificación de leche de vaca, oveja, cabra y búfala en mezclas lácteas y quesos mediante la aplicación de técnicas genéticas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello se han abordado los siguientes objetivos: 1. Desarrollo de técnicas de PCR con cebadores específicos para la identificación de vaca, oveja, cabra y búfala en mezclas lácteas y en quesos. La diferenciación de la leche de vaca, oveja, cabra y búfala mediante técnicas genéticas exige una cuidadosa elección de los marcadores genéticos que se van a utilizar para la identificación. El marcador elegido fue el gen 12S ARNr, cuyo análisis permitió la selección y el diseño de cebadores para su posterior empleo en las técnicas genéticas desarrolladas en este trabajo. A partir de las secuencias disponibles en las bases de datos, se diseñaron los oligonucleótidos conservados 12SSQDIR y 12SSEQINV, que amplificaron un fragmento común del gen 12S ARNr de vaca, oveja, cabra y búfala. La secuenciación de los fragmentos amplificados con dichos cebadores, permitió el diseño de un cebador directo común (12SFWM) y cinco cebadores específicos de especie: 12SBTINV (vaca), 12SBTINV2 (vaca), 12SOAINV (oveja), 12SCHINV-12SCHDIR (cabra) y 12SBUFINV (búfala). El empleo del cebador 12SFWM junto con cada uno de los cebadores inversos, permitió por PCR la identificación específica de las cuatro especies objeto de estudio. Asimismo, se determinó la sensibilidad de la técnica de PCR desarrollada para detectar la presencia de leche de vaca y cabra en diferentes mezclas lácteas (crudas, pasteurizadas y esterilizadas) y quesos que contenían distintos porcentajes de la especie diana (100-0,1%). El límite de detección de la técnica de PCR, fue del 0,1% en todas las mezclas de leche y del 1% o inferior en las mezclas de quesos. Finalmente, se aplicó la técnica de PCR con cebadores específicos al análisis de diversos qu