Caracterización inmunoquímica y genética de la producción de las enterocinas L50, P y Q oir 2 "Enterococcus faecium L50"secuencia nucleotídica y análisis funcional de los plásmidos pCIZ1 y pCIZ2

Abstract

Durante esta Tesis Doctoral se han obtenido anticuerpos policlonales de especificidad predeterminada frente a la enterocina L50 (EntL50, sistema de dos péptidos [EntL50A y EntL50B]) y enterocina Q (EntQ), los cuales han sido empleados junto con anticuerpos frente a la enterocina P (EntP), obtenidos previamente, en diversos ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), lo que ha permitido la detección específica y la cuantificación de las enterocinas producidas por E. faecium L50. Además, la combinación de ensayos inmunoenzimáticos y microbiológicos ha permitido determinar el efecto de la temperatura en la producción de estas bacteriocinas. A este respecto, la máxima producción de EntL50 (EntL50A y EntL50B), EntP y EntQ se detectó en cultivos desarrollados a 25, 37 y 47ºC, respectivamente. El trabajo de investigación desarrollado continuó con la caracterización genética de la producción de enterocinas por E. faecium L50. Para ello, se procedió a la localización de los determinantes genéticos asociados a los fenotipos de producción e inmunidad de EntL50, EntQ y EntP mediante experiencias de hibridación ADN-ADN (Southern-blot) y curación plasmídica, lo que demostró que se encuentran ligados genéticamente y se localizan en los plásmidos pCIZ1 (aprox. 50 kb) y pCIZ2 (aprox. 7,4 kb) y en el cromosoma, respectivamente. A continuación, se inició la caracterización molecular de pCIZ1 y pCIZ2 mediante la determinación de su secuencia nucleotídica parcial y total, respectivamente. El análisis informático de las secuencias nucleotídicas obtenidas permitió identificar los hipotéticos genes presentes en estos plásmidos, entre los que se incluyen los que constituyen los operones y/o agrupaciones génicas implicados en la producción, inmunidad y/o secreción de EntL50, EntQ y EntP. En lo que respecta al plásmido pCIZ1, éste incluye 27 hipotéticos genes agrupados en cuatro regiones implicadas presumiblemente en la: (i) producción de EntP (orf1-3)