Utilización de técnicas genéticas y anticuerpos recombinantes para la detección de alérgenos alimentarios de origen vegetal

Resumen

A lo largo de esta Tesis Doctoral se han empleado diferentes metodologías tanto genéticas como inmunológicas para la detección de especies vegetales con potencial alergénico en alimentos. En primer lugar, se ha abordado el desarrollo de dos sistemas de amplificación dependiente de ligasa de múltiples sondas o MLPA para la detección simultánea de girasol, amapola, lino, sésamo y soja, y de cereales de declaración obligatoria en el etiquetado de alérgenos: trigo, cebada, centeno y avena. El sistema MLPA de semillas demostró un adecuado potencial para la detección múltiple y específica de las especies vegetales de interés alcanzándose un límite de detección de 10 mg por kg. De manera similar, el sistema MLPA de cereales consiguió la detección simultánea y específica de diferentes cultivares de los cereales de interés, presentando un límite de detección de 50 mg por kg. La aplicabilidad de ambos sistemas se corroboró mediante el análisis de diferentes productos comerciales y la posterior confirmación de los resultados por PCR en tiempo real, evidenciandose en varias muestras la presencia de una o más especies alergénicas no declaradas. Asimismo, se ha desarrollado una técnica de PCR en tiempo real con sondas de hidrólisis Taqman para la detección conjunta de las tres principales especies de cereales con gluten: trigo, cebada y centeno. El análisis de una mezcla binaria enriquecida con diferentes concentraciones dichos cereales indicó que la sensibilidad de la técnica dependía de la intensidad del tratamiento térmico aplicado a las muestras. Por tanto, el límite de detección del ensayo se estableció en el intervalo de 10 a 50 mg por kg, equivalente a una concentración teórica de gluten de entre 1 y 5 mg por kg. La aplicabilidad del método se demostró mediante el análisis de 220 productos comerciales y la posterior validación de los resultados obtenidos empleando el inmunoensayo oficial de ELISA para la determinación de gluten en alimentos. El sistema de PCR desarrollado, fundamentado en la selección de dos valores umbrales de Cp, permitió la discriminación cualitativa de alimentos con niveles de cereales con gluten potencialmente peligrosos para los consumidores sensibles y alimentos libres de gluten. Por otro lado, empleando la tecnología de phage display, se ha diseñado una nueva estrategia para la obtención de anticuerpos recombinantes frente al gluten que consistió en el cribado de una genoteca no inmune de anticuerpos de dominio único mediante selección por afinidad frente a un péptido sintético con repeticiones aminoacídicas presentes en el gluten. De este modo, se aislaron dos fagoanticuerpos específicos para la detección de gluten procedente de trigo, cebada y centeno. El fagoanticuerpo denominado dAb8E mostró las mejores cualidades para ser empleado como sonda de afinidad para el análisis de gluten en alimentos, alcanzando un límite de detección de 0,01 microgramos por mL al analizar diluciones seriadas de un estándar de gliadina y de 0,15 mg por g en mezclas binarias enriquecidas. Estos resultados evidenciaron el potencial de la técnica de ELISA basada en el fagoanticuerpo dAb8E para la detección de gluten en alimentos hasta una concentración de 20 mg por kg. El análisis comparativo de 50 productos comerciales mediante el inmunoensayo desarrollado y el ELISA comercial basado en el anticuerpo R5, mostró una buena correlación entre los resultados obtenidos por ambas técnicas. Por último, haciendo uso de las ventajas de la tecnología de phage display, se han obtenido vectores de expresión para la producción en la levadura Pichia pastoris de los anticuerpos recombinantes frente al gluten fusionados a proteínas con propiedades luminiscentes: la luciferasa Lucia y las proteínas rojas fluorescentes mCherry y DsRed Express2. La inducción de clones de P. pastoris transformados con las diferentes construcciones genéticas indicó que esta levadura es capaz de secretar anticuerpos funcionales fusionados a la proteína mCherry.