Caracterización y evaluación "in vitro" e "in vivo" de bacterias lácticas de origen acuático como probióticos para el cultivo del rodaballo ("Scophthalmus maximus L.")

Resumen

El objetivo global de esta Tesis Doctoral consistió en la caracterización y evaluación in vitro e in vivo de 99 bacterias lácticas aisladas de pescado, marisco y productos de la pesca para su empleo como probióticos en el cultivo del rodaballo, una especie de gran interés comercial para España. Para ello, se evaluó in vitro la actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas de origen acuático frente a ictiopatógenos, así como su seguridad. Además, se llevó a cabo la tipificación molecular de cepas de Enterococcus faecium mediante la técnica de electroforesis en campo pulsante y diversas técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa. Posteriormente, se evaluó in vivo la eficacia de las bacterias lácticas para la protección de Artemia franciscana frente a Vibrio campbellii empleando ensayos de exposición de cultivos gnotobióticos. Asimismo, se evaluaron in vitro los efectos de las bacterias lácticas viables e inactivadas sobre los leucocitos de riñón anterior de rodaballo, así como sus propiedades funcionales y probióticas. Por último, se evaluó in vivo la seguridad y el efecto inmunomodulador de dos bacterias lácticas seleccionadas por sus interesantes características probióticas. Los resultados obtenidos revelaron que la actividad antimicrobiana frente a ictiopatógenos Gram-positivos y Gram-negativos es una propiedad probiótica generalizada entre las bacterias lácticas caracterizadas en este trabajo. De las 99 bacterias lácticas evaluadas, 33 cepas pueden considerarse seguras debido a la ausencia de resistencia a antibióticos, factores de virulencia y actividades enzimáticas perjudiciales. A este respecto, la resistencia a antibióticos y los factores de virulencia se detectaron en un alto porcentaje de enterococos y, en menor medida, en las cepas no enterococales, describiéndose por primera vez el gen mefAE que confiere resistencia a la eritromicina en los géneros Pediococcus y Weissella, así como el gen lnuA de resistencia a lincosamidas en Pediococcus spp. De las técnicas evaluadas para la tipificación molecular de los enterococos, la técnica ERIC-PCR fue la más eficaz. Este es el primer estudio a gran escala que evalúa la seguridad in vitro de bacterias lácticas de origen acuático empleando una aproximación más exhaustiva que la establecida por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria para las bacterias lácticas con estatus QPS. Asimismo, este es el primer estudio que describe bacterias lácticas con actividad antimicrobiana frente a V. campbellii. A este respecto, los ensayos de exposición de cultivos gnotobióticos mostraron que E. faecium CV1 y Lactococcus lactis subesp. cremoris SMF161 protegen a A. franciscana frente a este ictiopatógeno. Por otra parte, ninguna de las 8 bacterias lácticas inactivadas evaluadas mostró efecto citotóxico en los leucocitos de rodaballo, mientras que sus formas viables ejercieron distintos efectos en la apoptosis de linfocitos y fagocitos. Asimismo, las bacterias lácticas viables estimularon el estallido respiratorio y la fagocitosis de los leucocitos más eficientemente que sus formas inactivadas. De estas 8 cepas, 7 presentaron actividad antimicrobiana frente a Tenacibaculum maritimum y Vibrio splendidus y la mayoría de ellas mostraron unas adecuadas propiedades funcionales y probióticas, tales como supervivencia en medio acuático marino, tolerancia a valores de pH bajos y a bilis de rodaballo, adhesión al mucus de piel de rodaballo e inhibición de la adhesión de estos ictiopatógenos al mucus. Leuconostoc mesenteroides subesp. cremoris SMM69 y Weissella cibaria P71 resultaron inocuas in vivo para las larvas y juveniles de rodaballo tras su administración mediante baño y mostraron la capacidad de modular la transcripción de genes de inmunidad en riñón anterior, bazo, hígado, intestino y piel en juveniles de rodaballo. Los resultados de los ensayos in vitro e in vivo demuestran que estas dos cepas poseen un gran potencial como probióticos para el cultivo del rodaballo.