Obtención y caracterización de anticuerpos recombinantes (scF y dAb) para la detección de nuez (Juglans regia) y pistacho (Pistacia vera) en alimentos mediante técnicas inmunoenzimáticas Elisa

Resumen

La alergia alimentaria es un problema de salud pública en auge. La exposición accidental de individuos sensibles a ingredientes alergénicos, incluso en pequeñas cantidades, puede desencadenar reacciones alérgicas severas. Para garantizar un alto nivel de protección de la salud de los consumidores, la Unión Europea obliga a mencionar en el etiquetado de los alimentos los ingredientes que figuran en el Anexo II del Reglamento (UE) 1169/2011, entre los que se encuentran la nuez y el pistacho. Con el fin de cumplir con las normas establecidas, las industrias y agencias encargadas de la seguridad alimentaria han de tener a su disposición métodos analíticos fiables, que permitan la detección en los productos alimenticios de los ingredientes causantes de las reacciones alérgicas. Los inmunoensayos son los métodos más utilizados para la detección de alérgenos, debido a su rapidez, sencillez, sensibilidad y capacidad de automatización. Sin embargo, todos los inmunoensayos disponibles se basan en el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales desarrollados en animales. La normativa internacional sobre el bienestar animal (Directiva Europea 2010/63/EU) fomenta el desarrollo de alternativas basadas en el principio de las ¿tres erres¿: reemplazar, reducir y refinar el uso de animales en los procesos de investigación y experimentación. El desarrollo de anticuerpos recombinantes y técnicas inmunoenzimáticas basadas en ellos, que no dependen de la inmunización animal, es una alternativa novedosa y prometedora para la detección de alérgenos. En este contexto, esta Tesis Doctoral supone un avance en el desarrollo de técnicas para la detección de alérgenos alimentarios, al haber conseguido la obtención y la caracterización de anticuerpos recombinantes frente a alérgenos de nuez (Juglans regia) y pistacho (Pistacia vera) mediante la técnica de phage display a partir de genotecas comerciales producidas sin inmunización de animales. Los anticuerpos recombinantes obtenidos han permitido el desarrollo de técnicas inmunoenzimáticas ELISA para la detección de nuez y pistacho en alimentos. Utilizando la tecnología de phage display y diferentes estrategias de selección, se han obtenido fago-anticuerpos de tipo scFv y dAb específicos frente a nuez (scFv JR35) y pistacho (dAb PVF4), con los que se han desarrollado técnicas de ELISA indirecto para la detección de estos alérgenos en alimentos. Asimismo, se ha llevado a cabo la identificación y caracterización de las proteínas reconocidas por estos fago-anticuerpos. Empleando técnicas electroforéticas, cromatográficas, espectrométricas, y de ultracentrifugación, se ha determinado que los anticuerpos recombinantes reconocen epítopos en la subunidad básica de la globulina 11S de la nuez y el pistacho, alérgenos Jug r 4 y Pis v 2, respectivamente. Para mejorar la sensibilidad y la avidez de los anticuerpos seleccionados se ha llevado a cabo una modificación funcional de los anticuerpos recombinantes mediante su biotinilación in vivo en el organismo eucariota Pichia pastoris y su multimerización con un núcleo de avidina. El scFv multimérico específico de nuez (JrBSF) se utilizó para el desarrollo de un ELISA directo, aumentando su sensibilidad con respecto al fago-anticuerpo. Por último, el análisis de una gran variedad de productos comerciales mediante las técnicas ELISA desarrolladas ha permitido identificar fraudes de etiquetado, así como detectar nuez y pistacho en productos en los que no se advertía de su presencia.